第三章_基因工程(...ppt

第四章基因工程 2 中心法则 1958年Crick提出了遗传信息传递的中心法则DNA的功能是转录 它控制生命的遗传和生长 而它的基本结构不受生物活动和变化的影响 它是最保守的大分子 忠实地复制自身 抵制一切变革和进化 进化是起因于DNA偶然复制错误 众多的偶然复制错误 只有通过天择才能优胜劣汰 使生物不断地进化 中国人民解放军福建前线炮兵部队遵照彭德怀部长1958年10月20日下午三时的命令 于20日下午四时对金门地区蒋军地面军事目标和金门海域蒋军舰只进行了惩罚性的打击 RNA的转录 DNA中的信息首先必须转录成mRNA1 RNA聚合酶结合于DNA分子上的特定位置2 DNA解链 起始RNA合成3 RNA链的延伸4 RNA合成的终止和释放这个过程直接启发了DNA分子杂交的技术手段诞生 核酸的分子杂交 逆转录 reversetranscription 和逆转录酶 以RNA为模板在逆转录酶 依赖于RNA的DNA 催化下合成DNA的过程逆转录酶在病毒retrovirus中发现 负责将病毒RNA逆转录成cDNA 进而成为双螺旋DNA 整合到宿主细胞的染色体DNA中去反转录病毒 Retrovirus 是轮状病毒 包括肠病毒 AID后天性 或获得性 免疫病毒 即AIDS 均属Retrovirus病毒之家族 这是一种隐藏于牛奶 血液 外生 及精子 卵子透过DNA潜伏病毒 内生 的病毒 它促成或直接造成发炎 癌症 肿瘤 神经系统病变 风湿性关节炎及肌肉炎 反转录病毒很厉害 显而易见的废话 它能利用一种反转传输酵素 ReverseTranscriptase 把自己的DNA插入到别的动物的DNA内隐藏 然后等待机会 如细胞老化了 身体免疫力变差了 身体的毒素太多的时候 也就是人体的免疫细胞 杀手细胞或淋巴细胞等 已没有能力处理这些病变细胞的时候 癌症 AIDS 其他疾病 或引起新的细胞突变繁殖等问题就出现了 其实 这也是各种病毒都会有的能力 照片中的蓝色部分就是H5N1禽流感病毒 下面的红色部分则是健康人体细胞 照片显示H5N1正在攻击健康的细胞 瑞典 每日新闻报 刊登出一组由高倍电子扫描显微镜拍摄的H5N1型禽流感病毒高解析特写照片 该报声称这组照片乃全球独家首发 SARS 非典 因为它具有极强的传染力和致命性 这个病在半年左右的时间内 传播到全世界二十多个国家 成为了世界卫生组织 WTO 和多个国家开始全力着手研究 预防和寻找治疗方法的新型传染病 世界卫生组织将这次出现的 非典 正式命名为SARS 中文译音 萨斯 是英文SevereAcuteRespiratorySyndrome的缩写 译文为 严重急性呼吸系统综合症 SARS的致病原因 世界卫生组织已公布 是病毒 而不是细菌或衣原体 这就是为什么各种抗菌素对此病无效的原因 病毒是世界上最小的生物 它比细菌 衣原体的组成简单得多 仅由一个蛋白质外壳和包在其中的遗传物质核酸分子 DNA或RNA 组成 引发SARS的病毒是冠状病毒的变种 冠状病毒的名称来源于在电子显微镜下此类病毒呈现出有一个花冠状外围的形态 在自然界中 冠状病毒广泛存在于动物体内 宿主包括啮齿动物 鸟类 其它脊椎动物和人 冠状病毒进入人体后 会引起急性 亚急性或慢性发病 最典型的是通常在冬季或春季在人群中引发的上呼吸道感染 被称作 流行性感冒 医学界曾注意到冠状病毒有引发胃肠道感染的可能性 在动物中 冠状病毒会引起啮齿动物传染性支气管炎 猪的胃肠炎 冠状病毒所含的核酸分子为线型单链RNA 组成此链的核苷酸序列就是病毒的遗传信息 它决定了病毒的性状 这条单链RNA与壳包核酸蛋白形成核酸蛋白复合体 这个复合体外包裹着一个被膜 被膜由蛋白质组成 被膜上的几种特异性糖蛋白为冠状病毒的分类提供了血清学检测基础 冠状病毒颗粒的大小为60 220毫微米 预防SARS 这就是为什么预防SARS 需要带12层以上的厚口罩 而要消毒环境以杀灭SARS病毒 需要选用能使蛋白质和核酸分子失活的消毒剂 过氧乙酸 酒精等 的道理 SARS病毒的出现与我们的环境行为 是什么原因导致了SARS病毒的出现 目前还没有解释 从科学的角度来推测 较大的可能性有两种在宰杀或生吃某种野生动物时 使原本仅寄生于动物身上的SARS病毒 传染到了人身上 由于人类对该病毒完全没有免疫力 SARS病毒进入人体后显示出了极高的致病性和传染性由于病毒基因的变异 使本身对人体毒性不大的冠状病毒发展成为杀伤力极强的新型病毒 致突变物质有可能会起到的作用 主要有 放射性类 染料类 涂料类 农药类 药物类 表面活性剂 洗涤剂类 塑料制品类和塑料垃圾简易焚烧产生的二噁英等 这些物质在我们当今生活中的用量一直在快速上升 而使用废弃后几乎没有任何安全处置的管理 于是这些污染物被大量释放到了自然环境中 进入了土地 甚至通过水流被带到了更为广泛的区域 致突变物质有可能会起到的作用 近几年媒体刊登过几张在城市郊区发现了三条腿的青蛙 长着两个头的蛇的照片 这是我们周边的环境中致突变物的积累已达到严重程度的信号 由于病毒的核酸分子结构简单 当环境中的致突变物通过食物或水进入到病毒的宿主体内 引起病毒基因发生变异的可能性是很大的 遗憾的是 这种致突变物污染的危险往往要等到出现了明显的变异物种 并引发了某种直接对人类造成的灾难 才会真正引起人类对治理污染的重视 不管SARS病毒会是来自以上哪一种推测 都与人类不文明的环境行为直接相关 食用野生动物的恶习是万万不能继续下去了 国家要尽快立法彻底禁止一切食用野生动物的现象 另外要高度重视对国际上已确认为致突变物的管理和专业化处理 对商品行业要强行要求减少塑料类包装物 因为这些塑料废弃后大量进入了生活垃圾 在我国广大的农村和城市郊区 就地简易焚烧生活垃圾的现象十分普遍 而这种焚烧会产生二噁英 一种强致突变物 已是不争的事实 干细胞 一个颠覆传统的话题 干细胞的定义在细胞的分化过程中 细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力 最终衰老死亡 机体在发展适应过程中为了弥补这一不足 保留了一部分未分化的原始细胞 称之为干细胞 stemcell 一旦生理需要 这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞 即干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞 细胞的分化 细胞分化 celldifferentiation 同一来源的细胞 通过细胞分裂在细胞间产生形态结构 生化特征和生理功能有稳定性差异的过程 细胞分化是个体发育中组织器官形成的基础细胞分化是发育生物学的中心问题 时间上的分化 一个细胞在不同的发育阶段有不同的形态结构 生化特征和生理功能 如骨髓内血细胞的发生过程空间上的分化 同一种细胞的子代细胞所处的环境位置不同 其形态结构 生化特征和生理功能也不一样 如外胚层来源的细胞可发育成表皮细胞 神经细胞等 干细胞的特点 1 干细胞本身不是处于分化途径的终端 2 干细胞能无限的增殖分裂 3 干细胞可连续分裂几代 也可在较长时间内处于静止状态 4 干细胞通过两种方式生长 一种是对称分裂 形成两个相同的干细胞 另一种是非对称分裂 由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配 使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞 另一个保持亲代的特征 仍作为干细胞保留下来 分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制 可以说 干细胞是具多潜能和自我更新特点的增殖速度较缓慢的细胞 干细胞的分类 根据个体发育过程中出现的先后次序不同 干细胞又可分为胚胎干细胞和成体干细胞 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞 根据其发育阶段 它包括胚胎干细胞和成体干细胞 胚胎干细胞是一种高度未分化细胞 它具有发育的全能性 能分化出成体动物的所有组织和器官 包括生殖细胞 成体干细胞是存在于成年动物的许多组织和器官 比如表皮和造血系统 具有修复和再生的能力的细胞 在特定条件下 成体干细胞或者产生新的干细胞 或者按一定的程序分化 形成新的功能细胞 从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡 过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞 最近研究表明 成体干细胞普遍存在于机体的大多数组织器官中 在胚胎的发生发育中 单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官 在成年动物中 正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生 胚胎的分化形成和成年组织的再生是干细胞进一步分化的结果 传统观点认为 胚胎干细胞是全能的 具有分化为几乎全部组织和器官的能力 而成年组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性 只能分化成特定的细胞或组织 这个观点目前受到了挑战 最新的研究表明 组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能 也就是说干细胞具有横向分化的能力 这为干细胞的应用开创了更广泛的空间 翻译 蛋白质的生物合成 将以核苷酸形式编码的在mRNA中的信息转变为多肽链中特定的氨基酸序列需要大约200多种以上的生物大分子 其中包括核糖体 mRNA tRNA 氨酰tRNA合成酶 各种可溶性的蛋白因子 起始因子 延伸因子 释放因子 等参加并协同作用 基因工程工具酶 基因工程的关键技术是DNA的连接重组 在DNA连接之前必须进行加工 把DNA分子切割成所需片段有时为便于DNA片段的连接 还需对DNA片段末端进行修饰 一般把DNA分子切割 DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶称为工具酶 工具酶分为三大类 限制性内切酶连接酶修饰酶 限制性内切酶定义 识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制性内切酶 简称限制酶 restrictionendonedeases 限制性内切酶命名 根据微生物的学名进行命名 一般取三个字母 即微生物属的第一个字母大写 种名的前两个字母小写 如果该微生物有不同的变种和品系 则后接变种和品系的第一个字母 从一种微生物细胞中发现几种限制性内切酶 则根据发现和分离的顺序用罗马数字表示如 从EscherichiacoliR株分离到的第一种限制性内切酶命名为EcoRI 限制性内切酶的分类 1 I类和III类限制性内切酶在同一蛋白中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性I类结合于识别位点 但是对结合位点随机切割 不能形成稳定的末端III类在识别位点上进行切割 然后从底物上解离下来2 II类限制性内切酶能识别特定的核苷酸序列 其长度一般为4 5 6个核苷酸且中心对称具有特定的酶切位点 限制性内切酶的性质 1 识别序列严格的专一性 通常被切割的碱基序列是回文序列 palindromicsequence 2 切割位点切割磷酸二酯链 它只能水解3 酯键 产生3 羟基 5 磷酸基片段平末端和粘末端 平末段和粘末端 BamHIG3 5 GATCCCCTAGG5 3 GPvuIICAG3 5 CTGGTC5 3 GACKpnIGGTAC3 5 CC5 3 CATGG 同裂酶和同尾酶 根据切割效果 同裂酶 isoschizomer 来源不同 但是能够识别相同的序列同尾酶 isocaudamer 识别序列不同 但是能产生相同的粘末端 如TaqI ClaI等等都能产生5 CG凸出的粘末端同尾酶在DNA片段重组时特别有用 连接酶 将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶称为连接酶T4DNA连接酶最为常用 催化DNA5 磷酸基和3 羟基之间形成磷酸二酯键大肠杆菌的DNA连接酶需要有辅助因子NAD 的参与才能进行催化反应 修饰酶 1 DNA聚合酶 DNAPolymerase 2 逆转录酶RNA cDNA3 T4多核苷酸酶标记5 端 制备杂交探针在化学合成中 磷酸化5 端用于测序引物中的5 端磷酸标记4 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶 1 大肠杆菌的细菌性碱性磷酸酶 BAP 2 牛小肠碱性磷酸酶 CIP CIP比BAP活性高10倍以上 而且对热敏感 便于加热使其失活碱性磷酸酶能将末端5 磷酸基团变为羟基 1 去除DNA片段中的5 磷酸 防止重组中的自身幻化 提高重组效率 2 去除非标记磷酸 核酸酶BAL31脱氧核糖核酸酶I DnaseI 外切核酸酶III从核酸两头开始降解这三种酶也经常用于核酸分子的修饰和降解 载体 承载外源DNA基因片段并带入受体细胞的传递者称为载体 vector 用于原核生物宿主的载体用于真核生物宿主的载体用于植物宿主的载体用于动物宿主的载体 质粒载体 质粒广泛存在于细菌中 在某些蓝藻 绿藻和真菌细胞中也存在质粒1 双链环状2 相对分子量很小3 自主或半自主复制4 不同生物质粒中的基因种类不同 用于原核生物宿主载体 质粒载体 plasmid 噬菌体载体 理论上 所有细菌株系都含有质粒 F质粒 携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息R质粒 携带了某种抗生素的抗性信息降解质粒 携带有参与或者控制一些不同寻常的代谢途径的基因 质粒的复制和遗传独立于染色体 每一个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列 它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制质粒的复制和转录依赖于宿主细胞所编码的酶松弛型质粒 其复制不需要质粒本身编码的功能蛋白 完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的酶 可达2000 3000拷贝数 严紧型质粒 要求同时表达一个有质粒本身编码的蛋白酶 pBR322 Bolivar和Rogigerus两位优秀学者的杰出作品P plasmidBR 学者的姓322 与两位学者有关的编号 pBR322 大小为4363bp一个复制起点 这个起点能保证该质粒只能在大肠杆菌里行使复制功能多个酶切位点 共36个单一的限制性内切酶位点一个抗氨苄青霉素 Amp 基因 PstI 一个抗四环素 Tet 基因 BamHI SalI和HindIII 利用抗生素基因失活来筛选重组体是最方便的了可容纳5kb左右外源基因 用碱性磷酸脂酶处理后 除去5 末端磷酸基团 以避免产生不必要的连接产物 pUC18 192686bp带有一个氨苄青霉素抗性基因带有一个 半乳糖苷酶基因与pBR322同样的复制起始位点有多个单克隆位点 好的载体 克隆位点具有可选择性鉴定插入DNA重组质粒方法简单 噬菌体载体 出于对构建更大DNA片段的需求而发展的载体 质粒载体可以克隆的片段大小在10kb左右 噬菌体含有双链环形 单链环形 双链线型 单链线型等多种形式 大小不一的DNA 且感染率高 噬菌体及其特征 长度为48502bp的线型双链宿主细胞中末端粘合的位点称为 cos是温和噬菌体 DNA可以整合到宿主细胞的染色体上 以溶原状态存在 随染色体复制而复制 包装长度的优势 包装长度为75 105 约38 54kb 即使本身噬菌体不被改造 也能载承5kb大小的外源DNAD基因和E基因 DNA上的D基因和E基因对包装的作用至关重要 缺一不可 该两种基因编码了积累宿主细胞内的蛋白外壳基因 DNA上的酶切位点 种类很多 非常便于外源基因的插入和置换 但是存在位点挑选的困难和技术复杂性 比如相对于一种酶有可能有多个位点 噬菌体载体的构建 抹去某种限制酶在 DNA的识别序列 只在非必须区内保留1 2个识别序列 保留一个位点可以进行外源基因插入操作保留两个位点就可以进行置换用合适的限制酶切去部分非必须区 但是不应使载体小于38kb在载体分子合适区域插入可供筛选重组体的标记基因 例如抗生素抗性基因 没有适用于克隆所有DNA片段的万能 噬菌体载体 选择合适载体时应考虑到 所要用的限制性内切酶将要插入的外源DNA大小载体是否是需要在E coli中所要表达克隆的DNA筛选方法 在设计之初就应该考虑利用哪一种抗生素基因 人工载体 用于真核生物宿主的人工载体大多具有大肠杆菌质粒的抗药性和噬菌体强感染力 同时满足携带真核生物的目的基因大片段DNA柯斯质粒是将 噬菌体的粘性末段和大肠杆菌质粒的抗氨苄青霉素和抗四环素基因相连而获得的人工载体 含一个复制起点 一个或多个限制酶位点 一个cos片段和抗药基因 能加入40 50kb的外源DNA 这种质粒综合了质粒载体和噬菌体载体的优点可按质粒载体转化受体菌 并在其中复制也可按噬菌体载体在体外包装转导受体细胞 并在其体内环化复制 用于真核生物宿主的载体 真核细胞的基因表达调控要比原核细胞基因复杂得多 目前所用的真核载体大多数是所谓 穿梭载体 shuttlevector 这种载体具有在原核细胞体内将基因装配好 再转到真核细胞内的功能 在两种细胞内都能复制 扩增和表达 穿梭载体必须具备以下条件 1 原核基因的复制起始序列和筛选标记 以便在E coli中扩增筛选2 真核基因的复制起始序列和筛选标记3 有效的启动子序列 以保证下游的外源基因有效的转录和起始4 具有合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点 人工染色体质粒 开展人类基因组 水稻基因组工程的工作需要容纳更长DNA片段的载体整合质粒 YIP 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段组成 可以和受体或宿主的染色体DNA同源重组 整合进入宿主染色体中 所以只能以单拷贝形式存在 复制型载体 YRP 同样由大肠杆菌质粒和酵母DNA片段组成 但酵母DNA片段不仅提供抗性基因筛选标志 而且带有酵母自身的复制顺序 ARS 由于大肠杆菌质粒本身有一个复制点 所以这类质粒能在细菌和酵母中存在 通常也被称为穿梭载体 通过这类载体 可以在大肠杆菌中大量复制真核基因 然后再转入酵母中 YAC 酵母人工染色体yeastartificialchromosome 酵母细胞中克隆外源DNA大片段的克隆体系CEN 着丝点 主管染色体在细胞分裂中正确分配到各子细胞TEL 端粒 对染色体末端的复制和防止外切酶作用ARS 自主复制序列 与质粒上的复制起始位点相似能装载100万碱基以上的片段实际上YAC是以质粒的形式出现的 用于克隆时 先要用酶进行酶解 形成真正意义上的人工染色体 BAC 细菌人工染色体bacterialartificialchromosome 以细菌的F因子为基础组建的细菌克隆体系拷贝数低 稳定 比YAC易分离 对外源DNA包容可达300kb可以通过电穿孔导入细菌细胞 植物和动物宿主载体 植物细胞的结构比较特殊 所以外源基因的导入方法很有限Ti质粒 存在于农杆菌中 通过植物伤口入侵植物体内 然后质粒才会整合到植物染色体中 是一种诱发肿瘤的质粒 其缺点是酶切位点太多 DNA分子过长 植物病毒 宿主范围狭窄 可插入片段短 易丢失 插入外源基因后感染力下降 植物转座子 因其在植物基因组中频繁转移 正在热门研究中 哺乳动物用于外源DNA表达采用的载体至今很有限 目前主要用猿猴空泡病毒40 SV40 载体的必备条件 1 能够进入宿主细胞与染色体相比 载体的大小显得微乎其微 载体都不具备独立生存能力 载体本身只不过是个DNA或者RNA分子 载体进入细胞 相当于一个分子进入细胞 载体的必备条件 2 载体可以在宿主细胞中独立复制 本身是一个复制子必须含有复制起始位点 利用自己的编码或者宿主的复制酶进行复制当外源DNA插入时 都不会破坏其原有的复制能力载体在宿主细胞中起初只有一个 但是可以通过复制实现扩增 如果没有扩增 就无法筛选重组体 载体的必备条件 3 要有筛选标记4 对多种内切酶有单一的或者较少的切点 最好是单一切点5 携带外源DNA的载体进入宿主细胞后会以两种形态存在结合态并存 载体的分类 1 以繁殖DNA片段为目的的载体2 穿梭载体3 表达载体凡是成功得到克隆的基因片段 都希望能在宿主细胞中得到高效率的表达 这是真正实现基因工程克隆目的的载体 吃饭去吧 目的基因的获得 基因的组成和分类 1 结构基因决定某一种蛋白质分子结构相应的一段DNA 可将携带的特定遗传信息转录给mRNA 再以mRNA为模板合成特定氨基酸序列的蛋白质2 调节基因带有阻抑蛋白 控制结构基因的活性3 操纵基因位于结构基因的一端 与一系列结构基因合起来形成一个操纵子 平时阻抑蛋白与操纵基因结合 结构基因没有活性 不能合成酶或蛋白质 当有诱导物与阻抑蛋白结合时 操纵基因负责打开控制结构基因的开关 于是结构基因就能合成相应的酶或蛋白质作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子 基因编码区和转录终止子 启动子是DNA上RNA聚合酶识别 结合和促使转录的一段核苷酸序列起始位点为转录mRNA的第一个碱基终止子是一个提供转录停止信息的核苷酸序列基因编码区包括 起译码ATG 开读框 目的基因自带 和休止码TAA 或者TAG TGA 结构基因和调控基因 为了区分调控过程中的调控成分和其调控的基因 使用结构基因 Structuralgene 和调控基因 Regulatorgene 的概念 结构基因是编码蛋白质或RNA的任何基因 结构基因编码大量结构和功能各异的蛋白质 包括结构蛋白 具有催化活性的酶和调控蛋白 调控基因是参与其它基因表达调控的蛋白质的结构基因 两者其实都可以当作结构基因看待 调控的关键是调控基因编码的蛋白质通过与DNA上的特异位点的结合来调控转录 这种相互作用可以通过正 Positive 调控的方式 打开基因的作用 和负 Negative 调控的形式 关闭基因的作用 来调控一个靶基因 Targetgene 它们在DNA上的位点通常但不是专一的位于目的基因的上游 位于转录单位开始和结束位置上的序列为启动子 Promoter 和终止子 Terminator 两者都是典型的顺式作用位点 启动子只能作用于同一链上的DNA的一个基因或物理连接上的几个基因使其开始转录 同样 终止子也只能终止它所在基因的RNA聚合酶转录 细菌的启动子可能具有一个或多个紧密相连的位点 即和起始位点紧密连接 细菌的传统控制机制是负调控 阻遏蛋白阻止基因表达 在缺省状态下 RNA聚合酶能够识别它的启动子 使基因得到表达 与启动子相邻的另一个顺式作用位点称为操纵基因 Operator 它是阻遏蛋白的靶位点 当阻遏蛋白和操纵基因结合时 就会阻止RNA聚合酶启动转录 基因的表达因而被关闭 真核生物的启动子可能具有更多的位点 它们相隔比较长的距离 原核生物目的基因的获得 1 基因文库的建立 GenomicDNAlibrary 将