H-E染色.doc

H-E染色概 述 苏木精（Hematoxylin）-伊红（Eosin）染色也称普通染色，简称为H-E染色。是生物组织学、病理学及细胞学工作必不可少的最常用的染色方法，故又称常规染色 H-E染色应该是红蓝相映，层次浓淡均为分明稳恒定优质 各种固定、包埋方法所制作的组织切片和冰冻切片等，均可用采用常规染色 H-E染色原理 组织细胞的不同成分对苏木精染料的亲合力不同，经苏木精染色的组织切片，再利用酸乙醇的分化作用，可使细胞核等酸性成分着色清晰，而其它成分脱色 再经伊红染细胞质等碱性成分，则各种组织与病变的一般形态结构均可显示出来 一张优质的染色切片，可以清晰地观察到各种不同的组织结构以此作为病理诊断的确切依据 再根据此染色切片所见，分别进行不同的特殊染色 到目前为止人类所积累的病理组织学知识，绝大部分是从观察苏木精-伊红染色标本所得来的 第一节 染液及溶液的配制一、明矾苏木精染液的配制 苏木精染液的配法很多，普通、常规染色多用明矾苏木精，常用的有哈瑞（Harris）、埃利希（Ehrlich）、德拉菲而德（Delafield）及迈耶（Mayer）等 明矾苏木精染液用钾明矾或铵明矾中的铝离子作为苏木精的媒染剂 利用氧化汞等氧化剂进行人工氧化或通过自然氧化成熟的方法，使苏木精具有较强的染色效果 还需用冰醋酸作为促染剂，以增强染色能力（一）哈瑞斯（Harris）苏木精染液1配方（1）甲液 苏木精 1g 无水乙醇 10ml（2）乙液 钾明矾 （硫酸铝钾） 20g 蒸馏水 200ml（3）其他 氧化汞 0.51g 冰醋酸 0.51ml 2配制法 分别配制甲、乙液，将乙液（加温并搅拌），待全部溶解后，再加入甲液，混合后煮沸12分钟，然后改用小火加温，慢慢加入氧化汞，同时不停地摇荡或搅拌使其充分氧化，当液体变为深紫蓝色时，即迅速将容器放入入冷水中使之迅速冷却，室温静置数小时至一夜。第二天过滤，每100毫升滤液内加0.51毫升冰醋酸，以增强其染色力 染色时间为315分钟 此液为人工氧化剂，配制方便，配后第二天即可应用，且染色时间较短，为临床病理常用之方法，保存时间不能太长，经26个月后染色作用渐弱，故现用现配为好，一次不宜配制过多，应按需要量随用随配 钾明矾为媒剂，氧化汞为氧化剂 ，冰醋酸为促染剂 二、伊红染液的配制 为砖红色粉末状或酱红色结晶，是最常用的胞浆染料 伊红有水溶性和醇溶性，黄光（Y）与蓝光（B）之分 病理组织学常规染色一般多用水溶性伊红Y 伊红染液的一般浓度为0.251。常规染色常用O.250.5；快速染色时或偶尔遇到对伊红着染困难的组织，可使用0.51 浓度较低的易使胞质染色均匀，色调清晰、美观 （）水溶性伊红染液（二)醇溶性伊红染液10.5醇溶性伊红染液20.25醇溶性伊红染液（1）配方 醇溶性伊红（B） 0.5g 蒸馏水 5ml 95乙醇 200ml （2）配制法 先将伊红溶于蒸馏水中，待其溶解后摘冰醋酸于其中，有沉淀生成，至成浆糊状，再加蒸馏水数毫升，继续滴冰醋酸，直至沉淀不再增加。过滤，弃滤液留沉淀物，待其干燥后，溶于200毫升95乙醇中即可 3改良伊红配制法（1）配方 伊红（水溶性Y） 1g 蒸馏水 200ml 冰醋酸 30ml（2）配制法 将伊红溶于蒸馏水100ml中，然后边摇边滴冰醋酸，待伊红呈浆糊状，即加100ml蒸馏水，摇匀后过滤，将滤液弃之，将伊红同滤纸一并收入烤箱内烘干，烘干之改良伊红照常规用乙醇配制之 此法是将伊红经过酸化处理配之染液，染色效果较好，细胞浆呈粉红色，肌纤维呈鲜红色，红血球呈橙红色 三、分化液的配制（一）1盐酸乙醇 盐酸1ml+70乙醇99ml（二）0.51盐酸水溶液 盐酸0.51ml+蒸馏水99ml四、促蓝剂（弱碱性水溶液）配制（一）氢氧化铵水溶液（二）氢氧化锂水溶液 将氢氧化锂逐滴加入蒸馏水中，经搅拌后，用pH试纸检验溶液的pH，调正pH至8.0左右 四、石碳酸-二甲苯溶液配制 石碳酸10ml+二甲苯30ml第二节 染色方法及注意事项一、染色前的处理 无论用哪一种固定、包理方法所制作的切片，都必须经过适当处理方能进行色染 这里着重介绍常用的石蜡切片染色前的处理 石蜡切片在染色之前必须经过脱蜡至水，就是先用二甲苯等有机溶剂将组织切片上的石蜡溶解后，再用自高至低浓度的乙醇将不能与水混合的二甲苯溶掉；在经过各级乙醇的过程中，组织切片中的水分得到逐渐增加，直至最后水洗 步骤：二甲苯去蜡（二次,各510min ）;无水乙醇（二次）、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇（各12min）;自来水冲洗，蒸馏水洗二、染色 苏木精-伊红染色过程是先用苏木精将组织切片适当地过染，经水洗后再用盐酸乙醇分化、温水或弱减性水溶液显蓝，使胞核呈鲜明的蓝色，胞质等背景无色；再经水洗后用伊红将胞质等染成深浅不同的粉红至红色 步骤：苏木精染液(1015分钟),自来水洗(片刻),盐酸酒精分化 (12浸次),流水冲洗(片刻), 温水或碳酸锂饱和水溶液显蓝 (1分钟);流水冲洗(数分钟);伊红液染(数分钟) 三、脱水透明封固 绝大部分苏木精-伊红染色的切片标本，为了便于观察和长期保存，均应以干性封固剂封藏 凡是用干性封固剂封藏的各种切片标本在染色后，均需经过脱水、透明过程 可使存留在切片上之水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生出适宜的折光率，最后用盖玻片及封固剂封固 步骤：95%乙醇、无水乙醇(各二次, 12分钟);二甲苯(二次,1分钟);滴加中性树胶等盖盖玻片封片 步骤内 容时间(min)步骤内 容时间(min)1二甲苯512温水或碳酸锂液52二甲苯513自来水冲洗片刻3无水乙醇21490乙醇14无水乙醇215伊红乙醇染液15585乙醇21695乙醇2675乙醇217无水乙醇27自来水+蒸馏水洗518无水乙醇28苏木精染液5819二甲苯29自来水冲洗片刻20二甲苯210盐酸乙醇数浸次21滴中性树胶11自来水冲洗片刻22加盖玻片封固第三节 染色结果、易出现的问题及原因 一、H-E染色的结果 素木精-伊红染色结果为 细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒被染成深蓝色，粘液染成灰蓝色 细胞质被伊红染成深浅不同程度的粉红色至桃红色，胞质内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色，胶原纤维为淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红细胞为朱红色；核仁红色，蛋白性液体粉红色 着色情况不仅与组织、细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变 很多细胞在其新生时期胞质对伊红着色淡或者轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染 胶原纤维在老化和透明变性时，伊红着色由浅变深 质量好的苏木精-伊红染色切片标本，细胞核与细胞质蓝红相映，鲜艳美丽 胞核鲜明，核膜及核染色质颗粒均清晰可见 组织细胞的一般形态结构特点及很多物质成分，基本上均能显示出来 优良的苏木精-伊红染色切片标本，可以长期保存（数十年之久）且不明显褪色二、苏木精-伊红染色易出现的问题 最常见的是色调不正、两