外源性DNA残留量测定法(qPCR法).doc

重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法(qPCR法)1原理实时定量PCR（qPCR）扩增分2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长速度变慢，反应进入平台期。反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环数，即CT。CT值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物，产生高过背景的荧光信号，因此，反应就有一个小或早出现的CT；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的CT。两者之间关系的建立是qPCR用于定量的依据。2主要仪器表2 仪器信息表名 称厂 家型 号实时定量PCR仪Bio-RadCFX Connect3主要试剂表3 试剂信息表名 称厂 家规 格残留DNA样品制备试剂盒ABI1） Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle;2） Binding Solution,1 empty bottle;3） Wash Buffer Concentrate, 2 bottles, 26 ml/bottle;4） Elution Buffer; 1 bottle, 25ml;5） Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml;6） Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube;7） Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml;8） Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml,0.5ml;Glycogen, 2 tubes,5mg/ml,1.0ml/tube.残留DNA定量检测试剂盒（CHO）ABI1) DNA Control,1 bottle,40l;2) DNA Dilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml;3) 2Environmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube;4) 10DNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300l;5) Negative Control, 1 tube,1.0ml.4溶液配制4.1 蛋白酶K混合液（新配）附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR）1 reaction（100l/sample）10 reaction（100l/sample）Proteinase K10l100lProteinase K Buffer60l600l4.2 裂解混合液（新配）试 剂体 积（l）Glycogen（5mg/ml）180tRNA（10mg/ml）4Lysis Buffer7600合 计77844.3 DNA标准品稀释Tube labelDilutionpg/lpg/ reactionDNA Control30000300000SD110l DNA Control+990l DDB3003000SD250l SD1+450l DDB30300SD350l SD2+450l DDB330SD450l SD3+450l DDB0.33SD550l SD4+450l DDB0.030.3SD650l SD5+450l DDB0.0030.03NTCDDB00注：DNA标准品溶液4放置保存1天，-20放置保存1周。5测定方法5.1样品处理5.1.1除蛋白1）在2ml离心管中加入100l样品；2） 每100l的样品中加入70l的蛋白酶K混合液，混合均匀，56水浴30min；3） 每100l的样品中加入360l的裂解液，室温裂解2小时以上。5.1.2 DNA的纯化1）磁珠使用前于37温浴10min，高速涡旋，彻底悬浮磁珠；2）每100l的样品加入30l的磁珠悬浮液；3）每100l的样品加入300l的Binding Solution，涡旋混合5min；4）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置5min直至溶液清澈，弃上清；5）从磁力架上取下离心管，加入300l的Wash Buffer，涡旋混合5 sec；6）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，弃上清；7）重复步骤6）1次，打开离心管的盖子，室温下风干；8）加入50l的Elution Buffer，高速涡旋10 sec，70处理10min，在温浴过程中，涡旋23次；附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR）9）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，将含有洗脱DNA的液体转移到新的1.5ml的离心管中，用于进行qPCR反应。5.2 PCR反应体系1）标准品、NTC和样品均做2个复孔；2）反应母液用量按表4进行计算：表4 PCR反应体系Kit ReagentsVolume for 1 30-lreaction（l）Volume for 36 30-lreaction（l）Negative Control27210DNA Resl-Time PCR Assay Mix31082Environmental Master Mix15540DNA template10N/A合 计307205.3 PCR仪运行程序设置5.3.1 PCR反应体系1） 标准品、NTC和样品均做2个复孔；2） 反应母液用量按表5进行计算：表5 PCR反应体系Kit ReagentsVolume for 1 30-lreaction（l）Volume for 36 30-lreaction（l）Negative Control27210DNA Resl-Time PCR Assay Mix31082Environmental Master Mix15540DNA template10N/A合 计307205.2.2 PCR仪运行程序设置1）荧光基团选择FAM；2）96孔反应模块设置见下表，样品根据实际数量依次设置：123456789101112ASD1SD1样品1样品1BSD2SD2样品2样品2CSD3SD3样品3样品3DSD4SD4ESD5SD5FSD6SD6GNTCNTCH附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR）3）PCR反应条件设置步 骤温 度时 间（min:sec）19510:002950:103600:304GOTO 2，39循环4） 运行上述设置的程序。6