环维黄杨星D在大鼠体内的吸收、分布和排泄的研究排泄的研究.doc

环维黄杨星D在大鼠体内的吸收、分布和排泄的研究文红梅张正行（中国药科大学药物分析教研室，210009）李伟蔡皓（南京中医药大学中医药研究院，210029）摘要：本文研究了环维黄杨星D在大鼠体内的吸收、分布和排泄的体内过程。采用HPLC-MS(TOF) 法建立了生物样品（血浆、组织器官、尿液、胆汁、粪便等）中环维黄杨星D的含量测定方法，进行了方法学考察。大鼠生物样本（血浆、十一个组织匀浆、尿液、粪便匀浆、胆汁）中加入内标多奈哌齐后碱化，以液-液萃取法提取样品后，采用液相色谱-飞行时间质谱联用技术，以电喷雾（ESI）作为接口技术，选择环维黄杨星D的准分子离子（M+H+，m/z403）和内标多奈哌齐的准分子离子（M+H+，m/z380）作为测定离子，测定大鼠血浆中环维黄杨星D的浓度。优化的色谱条件：Lichrosper CN柱为色谱柱，甲醇-醋酸盐缓冲液（8020）为流动相，CVB-D与内标物分离完全，峰形对称，内源性物质不干扰样品测定。环维黄杨星D血浆浓度0.5200ngml-1线性关系良好（r=0.9999），组织浓度1400ngml-1线性关系良好；尿液、粪便、胆汁浓度1400ngml-1线性关系良好；提取回收率均高于80%。该测定方法具有灵敏、专一和快速的优点，符合生物样品分析要求。选用216只Sprague-Dawley大鼠灌胃(ig)环维黄杨星D，三个给药剂量5、10、20 mgkg-1的血药浓度-时间曲线符合一级吸收的二室模型，其吸收相、分布相、消除相半衰期分别为T1/2Ka1.220.34h， T1/22.020.28h， T1/219.590.90h，Tmax为2.56h0.62h，AUC分别为341.94、766.12、1836.53nghmL-1。对大鼠体内十一个脏器与组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、肌肉、脂肪、睾丸）5个时间点（2、6、10、12、24h），进行了组织器官的分布研究。环维黄杨星D分布广泛，除脑、睾丸、脂肪中浓度较低外，大部分组织中均有较大分布。其中在肝脏内分布量最大，其次为脾脏、肾脏和心脏。在肝脏中发现多个代谢产物，表明该药物可通过肝脏代谢。脑组织中能测到原型药物，说明环维黄杨星D能透过血脑屏障，向脑组织内分布。大鼠ig 给药环维黄杨星D 10 mgkg-1后，不同的时间收集的尿液、粪便、胆汁中均能检测出环维黄杨星D。以粪便中的排泄量较大，72h内粪便中原形药累计排泄量为36%；尿液中 72h原形药累计排泄量为0.66%；。胆汁中24h原形药累计排泄量占给药量的0.21%。关键词：环维黄杨星D；HPLC-MS；大鼠；吸收、分布、排泄 环维黄杨星D (cyclovirobuxine D，简称CVB-D) 是从黄杨科植物中国小叶黄杨Buxus microphylla Sieb.et Zucc.var.sinica Rehd. et willa及其同属植物中提取而得到的生物碱，现收载于中国药典2000年版一部。它具有行气活血，通络止血之功效。临床上主要用于气滞血瘀所致的胸痹心痛，脉结代；冠心病、心律失常患者常见上述证候者。本文按一类中药新药的要求，对血浆样本测定方法建立的基础上对环维黄杨星D在大鼠体内的吸收、分布、排泄的过程进行了系统研究，为环维黄杨星D及制剂的临床应用提供了科学的依据。实验部分1材料与仪器1.1 药品与试剂：环维黄杨星D灌胃给药样品（南京小营制药厂提供，经HPLC法检测含量98.5%，经HPLC-MS检测纯度为99%）。甲醇为色谱纯，水为高纯水，其他试剂为分析纯。硅胶（柱层析用，100-200目）青岛海洋化工厂生产。1.2 动物：Sprague-Dawley 大鼠，,体重180220g，由南京中医药大学实验动物中心提供,动物许可证：SYXK（苏）2002-0053。1.3 仪器：LC-DAD-ESI-TOF联用系统：Waters 2690 液相色谱仪，Waters 996二极管阵列检测器（美国Waters公司）；MarinerTM 5140质谱仪（美国 Applied Biosystem公司）：电喷雾离子化接口飞行时间质谱检测器。质谱工作站：MarinerTM工作站（4.0 版）。T25 Basic Ultra turrax组织匀浆粉碎机（JKIKF公司，MALAYSIA制造）；GS-15R冷冻离心机（美国Beckman公司制造）。2方法与结果2.1 给药方案及样品的采集2.1.1 血浆样品的采集 Sprague-Dawley大鼠216只，随机分为3组，每组雌雄各半，ig 给药，实验5、10、20 mgkg-1 3个剂量组。于给药0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，24，48，60小时后不同时间大鼠眼眶取血，肝素抗凝，1500rpm离心10min，分离出血浆，-18冰冻保存，每一时间点用6只大鼠，分别测定各鼠的血浆药物浓度。血浆样品的处理: 吸取大鼠血浆1.0mL，置10mL具塞离心管中，精密加入多奈哌齐内标溶液（2gmL-1）10L，3 molL-1NaOH 200L，涡旋10s，精密加入叔丁基甲醚-二氯甲烷（2:1）混合液5mL，涡旋3分钟，于3000rpm离心10min。精密吸取有机相4mL，在40水浴中用氮气吹干。残渣加甲醇200L溶解，注入液相-质谱联用仪中分析。2.1.2 组织样品的采集 Sprague-Dawley雄性大鼠30 只，随机分为5组，分别灌胃0.5mgmL-1环维黄杨星D溶液，给药剂量为10mgkg-1，给药容量为每200g大鼠 4mL。给药后2、6、10、12、24小时后处死动物，每时间点6只大鼠，立即取出心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、肌肉、脂肪、睾丸，用生理盐水洗去表面浮血，滤纸吸干，小肠、胃组织要剪开刮去内容物并清洗。肌肉、脂肪取约5g，其它取完整组织，称重。置冰箱中冷冻保存。心、肝、脾、肺、肾、肌肉等组织样品处理方法：测定时取出组织样品，解冻，剪碎，用一定比例生理盐水制成组织匀浆。取匀浆液适量，置于10mL具塞试管中，按血浆样品处理方法处理。胃、小肠、脑、脂肪、睾丸等组织样品处理方法：测定时取出组织样品，解冻，剪碎，用一定比例生理盐水制成组织匀浆。取匀浆液4mL，加入3molL-1盐酸溶液0.2mL，混匀，3000rpm离心10min，取清液1.0mL，置于10mL具塞试管中，按血浆样品处理方法处理。2.1.3 尿液及粪便的采集 取Sprague-Dawley大鼠6 只，分别置于大鼠代谢笼中，收集空白尿液、粪便作对照。灌胃给予0.5mgmL-1环维黄杨星D溶液，给药容量为每200g大鼠 4mL，给药后收集04、48、813、1323、2329、2933、3337、3747、4758、5872小时的尿液、粪便。测量收集的尿液体积。收集的粪便于红外灯下烘干，称重。尿液样品的处理：量取各时间点的尿样1.0mL(不足1mL者取全量)，按血浆样品处理方法。 粪便样品的处理：将粪便干燥品，研磨成粉，称取100mg粉末样品，加入生理盐水4mL， 3molL-1盐酸溶液0.2mL制成匀浆。取匀浆液1mL，加入6molL-1氢氧化钠溶液0.4mL，按血浆样品处理方法。 2.1.4胆汁的采集与处理 取Sprague-Dawley大鼠6 只，体重220g260g。给药前禁食12h，自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，手术台上固定，剖腹分离胆管，并插管引流胆汁，收集空白胆汁后，灌胃（ig ）0.5 ngmL-1环维黄杨星D溶液，给药容量为每200g大鼠 4mL，给药后收集1、2、3、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24小时大鼠胆汁，并测量胆汁体积。按血浆样品处理方法处理。2.2 LC-MS分析条件：色谱系统：色谱柱：Lichrospher CN（10m，4.6200mm）流动相：甲醇-醋酸盐缓冲液（内含0.15%醋酸铵，0.75%冰醋酸）（80:20）；流速：0.8mLmin-1。质谱检测参数：离子极性：正离子（positive）；离子化方式：电喷雾离子化（ESI）；检测离子： 环维黄杨星D m/z：403M+H+ ；内标离子：多奈哌齐m/z：380M+H+。质谱参数：Spray Tip Potential：5400V， Nozzle Potential：190V， Detector Voltage：2 250V，Nozzle Temperature：140。3 专属性试验在同一色谱条件下，测得大鼠各空白生物样品（血浆、十一个组织、尿液、粪便、胆汁等）及含药生物样品的典型色谱图（略）。由图可见，环维黄杨星D的保留时间约为7.5分钟，内标物盐酸多奈哌齐的保留时间约为5.8分钟。空白组织匀浆中均未见环维黄杨星D和内标多奈哌齐的色谱-质谱峰，各生物样品中环维黄杨星D与内标物色谱峰分离完全，内源性物质及杂质不干扰样品测定。4 线性关系考察精密吸取不同量的环维黄杨星D对照品溶液适量于9个具塞离心管中，以空白血浆配成每mL含环维黄杨星D 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng标准血浆样本。按上述血样处理方法自“精密加入内标溶液10L”起同法操作，并进行色谱分析。以环维黄杨星D峰面积（Ai）与内标峰面积（As）的比值(Ai /As)对浓度（C，ngmL-1）进行线性回归，共测得五条大鼠血浆的标准曲线，环维黄杨星D的峰面积比值与血浆浓度呈良好的线性关系，见表1。取出心、肝、脾、肺、肾、肌肉的空白组织，解冻，剪碎，用生理盐水（1：4）制成组织匀浆。将空白组织匀浆制成每mL含1、2、5、10、20、50、100、200、400ng 环维黄杨星D的组织样本，置于10mL具塞试管中，按上述血样处理方法自“精密加入内标溶液10L”起同法操作，并进行色谱分析。测定时取出胃、小肠、脑、脂肪、睾丸空白组织，解冻，剪碎，用生理盐水（1:4）制成空白组织匀浆，取空白匀浆液4mL制成每mL含1、2、5、10、20、50、100、200、400ng环维黄杨星D的组织样本，加入3molL-1盐酸溶液0.2mL，混匀，3000rpm离心10min，取清液1.0mL，置于10mL具塞试管中，自“精密加入内标溶液10L”起同法操作，并进行色谱分析。以环维黄杨星D峰面积（Ai）与内标峰面积（As）的比值(Ai /As)对浓度（C，ngmL-1）进行线性回归，得十一个组织器官各自的标准曲线，均呈良好的线性关系，见表1。将空白尿液、胆汁制成每mL含1、2、5、10、20、50、100、200、400ng 环维黄杨星D的样本，置于10mL具塞试管中，自“精密加入内标溶液10L”起同法操作，并进行色谱分析。取粪便，研碎，用生理盐水（1:4）制成空白粪便匀浆，取空白匀浆液4mL制成每mL含1、2、5、10、20、50、100、200、400ng环维黄杨星D的组织样本，加入3molL-1盐酸溶液0.2mL，混匀，3000rpm离心10min，取清液1.0mL，置于10mL具塞试管中，加入6molL-1氢氧化钠溶液0.4mL，混匀，自“精密加入内标溶液10L”起同法操作，并进行色谱分析。以环维黄杨星D峰面积（Ai）与内标峰面积（As）的比值(Ai /As)对浓度（C，ngmL-1）进行线性回归，得尿液、胆汁、粪便的标准曲线，见表1。Tab 1 Stamdard curve of cyclovirobuxine D in different samplesTissueStandard curverLiner rangeplasmaAi /As =0.01272+0.01930C(ngmL-1)0.99990.5200 ngmL-1HeartAi/As0.03530.0186 C(ngmL-1)0.99981400 ngmL-1LiverAi/As0.03480.0195 C(ngmL-1)0.99991400 ngmL-1SpleenAi/As0.02190.0201 C(ngmL-1)0.99991400 ngmL-1LungAi/As0.01480.0199 C(ngmL-1)0.99991400 ngmL-1KidneyAi/As0.02680.0200 C(ngmL-1)0.99991400 ngmL-1MuscleAi/As0.02270.0197 C(ngmL-1)0.99991400 ngmL-1StomachAi/As-0.0230.0194 C(ngmL-1)0.99981400 ngmL-1IntestineAi/As0.02850.0198 C(ngmL-1)0.99981400 ngmL-1BrainAi/As0.02660.0201 C(ngmL-1)0.99971400 ngmL-1FatAi/As-0.0300.0192 C(ngmL-1)0.99931400 ngmL-1TestisAi/As0.02540.0199 C(ngmL-1)0.99951400 ngmL-1UrineAi/As0.02020.0185 C(ng/mL)0.99991400 ngmL-1FecesAi/As0.05460.01996 C(ng/mL)0.99981400 ngmL-1BileAi/As0.05930.0186 C(ng/mL)0.99941400 ngmL-15 方法回收率与提取回收率的测定用血浆、十一个空白组织匀浆、尿液、粪便、胆汁分别配制高、中、低3种不同浓度的组织样本各5份，按各组织样本“线性关系考察”项下进行样品处理，并测定环维黄杨星D和内标多奈哌齐的峰面积由标准曲线测得实测值，以实测量与加入量之比计算出方法回收率，结果见表2。Tab2 Recovery of cyclovirobuxine D in different samples(n=5)SamplesMethod Recovery(%)MeanSDExtraction Recovery(%)MeanSDLowMiddleHighLowMiddleHighplasma92.789.5798.988.25102.01.8490.009.3793.584.0399.131.91Heart88.742.30105.11.7398.793.0490.737.9788.842.5889.501.03Liver87.862.48103.42.7398.612.2496.676.5794.068.1786.755.94Spleen82.753.84105.53.1799.132.3181.462.7578.090.9482.320.80Lung98.153.19101.22.5398.152.2699.871.9797.862.0297.163.22Kidney96.226.08104.22.4496.852.1990.531.8391.691.9693.912.92Intestine97.952.46105.23.7998.731.9583.6013.185.526.2293.535.64Stomach101.76.7799.894.9798.562.4088.983.3489.563.7297.780.98Muscle97.111.50101.13.3397.691.2092.271.8195.771.9695.831.65Brain91.944.09103.13.7497.482.9492.415.8189.512.7990.484.67Fat107.54.1090.421.5294.864.8783.925.5888.773.2379.814.52testis88.224.0798.383.8895.203.6895.222.7391.969.4396.797.08Urine98.703.0096.526.5296.602.1282.836.9186.584.0490.482.77Feces92.822.66102.55.8598.842.0772.586.9095.556.4192.992.78Bile90.9012.298.322.5694.352.8088.394.3992.643.5384.513.42 注：血浆样品低中高加入浓度分别为0.5、20、200 ngmL-1；其余生物样本低中高加入浓度分别为10、100、400 ngmL-16 大鼠体内吸收、分布、排泄的研究6.1大鼠血药浓度的经时过程 大鼠ig 低、中、高3个剂量后不同时间血浆中浓度分别见表3。用上述方法测定的ig 环维黄杨星D的高、中、低3个剂量的平均血药浓度-时间曲线见图1。Tab3 Concentration vs time (C(ngmL-1，n=6) Time(h)Dose:5mgmL-1Dose:10mgmL-1Dose:20mgmL-1MeanSDMeanSDMeanSD0.58.895.446.343.4219.989.49111.046.7838.2627.1041.0216.81223.268.464.9133.98152.4874.14335.6521.599.1682.23152.2165.59414.987.8138.0319.66100.5921.4617.4512.4649.6123.0398.0046.72810.343.5233.1810.7781.0067.59106.983.8719.541.1047.3914.89125.422.198.933.0337.879.79244.142.757.302.8920.877.82482.240.873.401.4110.363.88600.7800.2141.560.635.0921.14Fig1 Represent mean plasma drug concentration-time profiles of cyclovirobuxine D in rat after ig dose(5、10、20 mgkg-1) of cyclovirobuxine D (n=6，XSD)6.2大鼠体内的药动学参数 采用3p97计算软件计算的药物动力学参数见表4。Tab 4 Pharmacokinetic parameters of cyclovirobuxine D in rat after a single oral dose of 5、10、20 mgkg-1（two-compartment model）ParameterunitDose(mgkg-1)51020MeanSDAngmL-185.63185.25453.15alphah-10.38320.36270.2965BngmL-18.55913.7543.91betah-10.037360.034480.03442Kah-10.55780.78770.4464Lagtimeh0.080230.42920.3042V/F(c)Lkg-1143.788.41103.8112.028.5T1/2h1.8081.9112.3382.0190.281T1/2 h18.5520.1020.1319.590.90T1/2Kah1.2420.87991.5531.2250.335K21h-10.11680.072630.08955K10h-10.12260.17220.1140K12h-10.18120.15240.1274AUCmgmL-1h283.67657.01690.42CL(s)Lkg-117.6315.2211.8314.892.91T(peak)h2.5501.9513.1862.560.62C(max)ngmL-117.3061.3695.656.3 组织分布的研究 大鼠灌胃环维黄杨星D溶液10mgkg-1后，2，6，10，12和24小时测定组织中不同时间平均药物浓度见表5，组织分布图见图2。Tab5 Distribution of cyclovirobuxine D in rat after single ig dose of10 mgkg-1(ngg-1 ,n=6)TissueConcentration (ngg-1)2h6h10h12h24hHeart4150.63527.79348.06088.611199.13363.86973.22099.02572.3921.9Liver622082466494224436307978245209242680.13276.68307.67226.5Spleen12458288143404.81290239369.4171042605991759149.31492.5Lung1324.3608.83489.1703.33286.41094.23822.0724.11107.4143.8Kidney2167.62662.57927.56071.018518.84758.210240.42507.96587.51904.1Intestine2439074941581137161225450669198.335005147.53989.7Stomach2173.81022.62122.3606.62152.91085.51632.7570.1897.0199.4Muscle5107.63123.43920.82406.23191.21390.82767.4827.9809.3140.0Brain69.4950.7523.8631.2220.0106.685.7939.338.685.04Fat295.9151.9887.8307.1541.9180.8504.8147.6147.637.1Testis349.494.8531.6281.4721.4199.2197.572.969.610.8Fig 2 Distribution of cyclovirobuxine D in rats at different time after ig 10mgkg-1(n=6)6.4排泄的研究6只大鼠各时间段尿液、粪便、胆汁中环维黄杨星D的排出量见表6，平均累积排泄率见图3。Tab 4-4 Excretion of cyclovirobuxine D in rat after single ig dose of 10mgkg-1（n=6）Time(h)Amount excreted (g)Time(h)Amount excreted (g)UrineFecesBile0-121.657173.20-51.4090-245.166457.20-102.9980-367.961584.80-164.0450-489.594632.50-204.5270-72