用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项.doc

TRIZOL试剂警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。收到药品后，在室温下存储。以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。说明：TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它发展自Chomczynski 和 Sacchi的RNA一步抽提法。在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。RNA只留在水相中。转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。DNA的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至50-100mg，高至1g）和细胞（低至5106，高至107）都有良好的效果。其简单的操作方法允许同时处理大量样品。整个过程可在1小时内完成。用TRIZOL提出的总RNA不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。在PCR和扩大DNA酶梯度分离中，建议使用一个内含子中的两个引物。TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA的条带，以及介于0.1到0.3kb（tRNA, 5S）的小分子RNA的条带。所分离的RNA稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。谨防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。在处理RNA时需要注意以下规则。戴一次性手套。皮肤上往往沾有污染RNA的细菌或霉菌，并成为RNase的来源。训练良好的微生物学操作方法以避免微生物污染。使用无菌的一次性塑料实验用品和移液枪进行RNA操作，避免公共用具的Rnase交叉污染。例如，用RNA探针的实验室一般会用到RNaseA或T1以降低滤器背景，而任何不能丢弃的实验用品（如移液枪）可能沾有大量的RNaseA。TRIZOL可以有效防止RnaseA污染。下游样品的处理需要无RnaseA得玻璃或塑料器皿。玻璃器皿应该在150下烘烤4小时，塑料制品应用0.5M的NaOH浸泡10分钟，再用水充分冲洗，最后高压灭菌。其他注意事项：在装2ml体积的TRIZOL时，建议用透明的一次性聚丙烯管。用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并试验其能否经受1200gTRIZOL的离心力以及氯仿的腐蚀。不要使用泄露或有裂缝的管子。离心前小心地称重平衡。离心前玻璃管需用石蜡膜封闭管口，聚丙烯管必需加盖。RNA分离技术指南警告：使用TRIZOL时一定要戴手套和护目镜。避免接触皮肤或衣服。在化学通风橱操作，避免吸入其蒸气。除特殊情况外，试验操作及试剂存储温度都要求在15-30。需要但无需补充的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（用于焦碳酸二乙酯处理水）不含RNase水或0.5%SDS溶液（不含RNase水的配制：将水加入不含Rnase玻璃瓶，添加焦碳酸二乙酯至0.01%(v/v)，静置过夜，高压灭菌；SDS溶液的配制要用焦碳酸二乙酯处理的无菌水。）1 匀浆化a. 组织每50-100mg组织加入1mlTRIZOL在玻璃管中用电力匀浆机匀浆化。取样容积不能超过用于匀浆化的TRIZOL的体积的10%。b. 单层培养细胞将1mlTRIZOL加入3.5cm培养皿，用移液枪吹打几次，直接将细胞消化。TRIZOL的加入量取决于培养皿的体积（每10cm2加1ml），而非细胞数。如果加入不足会造成提取RNA被DNA污染。c. 悬浮培养细胞离心沉淀细胞。在TRIZOL中反复吹打使细胞消化。每5-10106个动物、植物或酵母细胞或每1107个细菌细胞加1ml消化剂。在加入TRIZOL之前先不要洗细胞，因为这会促进RNA的降解。如果需要破碎酵母或细菌细胞就要用到匀浆器。任选：当处理样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材料如肌肉、脂肪组织、植物的块茎部分等时，还需要添加额外的分离步骤。均一化结束后，在2-8下以12000g离心10分钟从匀浆中除去不容部分。该部分含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。脂肪组织样品需要将上层过剩的脂肪收集除去。每次都将清除过得匀浆液转移到新管中，加入氯仿，按前述步骤分离固液相。2相分离 将经过匀浆化处理的样品在15-30下孵育5分钟，使核蛋白复合体完全分离。每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿，小心加盖。用手剧烈震管子15秒，然后在15-30孵育2-3分钟。在2-8下以最高12000g离心力离心15分钟，混合物分为成下层红色苯酚-氯仿相、相界面和上层无色水相。RNA只存在于水相。水相体积约占均一化TRIZOL试剂体积的60%。3RNA沉淀 将水相转到新管，如果需要分离DNA或蛋白质的话保存有机相。向水相加入异丙醇沉淀RNA，每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇。在15-30下孵化样品10分钟，在2-8下以最高12000g离心力离心10分钟。通常不可见的RNA在离心后在管底形成胶状沉淀。4RNA洗涤 弃去上清。用75%乙醇洗涤RNA一次，每1ml每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇。涡旋混合样品，并在在2-8下以最高7500g离心力离心5分钟。5再溶解RNA 结束时简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟）。不要用真空离心的方法干燥RNA。防止RNA完全干燥非常重要，因为那样会明显降低RNA的溶解性。部分溶解RNA样品使其A260/280比 1.6。加入无RNase水或0.5%的SDS溶液，用移液枪吹打几次，在55-60下孵育10分钟，溶解沉淀。（如果RNA要用于酶促反应，就要避免加入SDS。）RNA也可以溶于100%的甲酰胺（去离子），-70保存。RNA分离注意事项：1 从少量组织（1-10mg）或细胞(102-104)样品中分离RNA：向组织或细胞中加入800lTRIZOL，用相同的方法加入氯仿按照相分离第二步操作。用异丙醇沉淀RNA之前，先加入5-10g淀粉作为转入水相的载体。为降低粘度，在加入氯仿之前现用26计量注射针剪切基因组DNA。淀粉留在水相与RNA一起沉淀出来。当浓缩至4mg/ml时淀粉不会抑制单链合成和PCR。2 匀浆化之后加入氯仿之前，样品可以存于-60到-70至少一月。RNA沉淀（第四步，RNA洗涤）可以保存在75%乙醇2到8下至少一周或-5到-20下至少一年。3 如果第二、三步的离心时间可以达到30-60分钟，最高可达2600的台式离心机也适用于本实验方案。DNA分离技术指南如RNA分离实验所述，完全除去水相之后，存在于相界面和酚相的DNA就可以从原来的匀浆中分离出来。经过沉淀和一系列的洗涤之后，将DNA溶于8mM的NaOH溶液。TRIZOL可以回收组织或培养细胞的全DNA，因而它可用于测定待分析样品的DNA含量。同时抽提基因组DNA，使每个基因组对应的Northern分析结果归一化成为可能，避免了总RNA或组织重量变化的影响。（基于不同来源，有的DNA沉淀在使用之前可能还需要进一步的纯化（如酚抽提）。需要但无需补充的试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠溶于10%乙醇75%乙醇8mM的NaOH1 DNA沉淀除去留在相界面以上的水相，用乙醇沉淀相界面和有机相中的DNA。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加0.3ml无水乙醇，倒置混匀。然后在15-30下存储2-3分钟，在2-8下以最高2000g离心5分钟沉淀DNA。小心除去水相对分离DNA的品质非常重要。2 DNA洗涤 除去上层的酚-乙醇，如果需要的话保留以备蛋白分离。在含0.1M柠檬酸钠的10%乙醇中洗涤DNA两次，每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加1ml洗涤溶液。每次洗涤，都将DNA沉淀在洗液中15-30下保存30分钟（周期性混合），并在2-8下以最高2000g离心5分钟。两次离心之后，将DNA沉淀在75%乙醇（每1ml TRIZOL，加1.5-2ml75%乙醇）15-30下保存10-20分钟（周期性混合），并在2-8下以2000g离心5分钟。DNA含量高于200g的沉淀或大量不含DNA的样品都需要在0.1M钠的10%乙醇溶液中再洗涤一次。 3再溶解DNA 在开放的管中空气干燥DNA5-15分钟。（不要用离心干燥，因为那将造成溶解困难。）用8mM的NaOH溶解DNA至终浓度为0.2-0.3g/l。从107细胞或50-70mg组织中分离的DNA需要加300-600l8mM的NaOH。建议将DNA重悬于弱碱，因为分离的DNA不易重悬于水或Tris缓冲液。8mM的NaOH溶液pH约为9，DNA溶解后应该很容易用TE或HEPES调节。在该阶段，DNA样品（尤其是源于组织的）可能会含有不溶性胶状物质（细胞膜碎片等）。用12000g离心10分钟除去不溶物，将含DNA的上清移至新管。溶于8mM的NaOH的DNA可以在4保存过夜；如果需要延长储存时间，就需要用HEPES调节pH至7-8（见表），并补充1mM的EDTA。调好pH后，DNA可保存于4或-20。DNA的定量和期待产率取一部分溶于8mM的NaOH的DNA样品溶液，与水混合，测定所得溶液的A260。用双链DNA的A260值计算其含量，一个A260单位相当于50g双链DNA/ml。要计算分析样品的细胞数时，可以假定每个人、大鼠、小鼠的二倍体细胞的DNA含量分别为：7.1g、6.5g、5.8g。应用：用PCR扩增DNA：用8mM的NaOH再溶解DNA后，用0.1mM的HEPES调节pH至8.4（见表）。加0.1-1.0g样品到PCR反应混合液，执行标准的PCR反应。限制性内切反应：用HEPES调节DNA溶液pH至预定值（见表），也可以选择用1mM，pH7-8的EDTA透析样品。每微克DNA用3-5单位酶。个别酶条件依照厂家建议，让反应进行3-24小时。在典型的测试试验中，80-90%的DNA是可消化的。DNA样品溶解的8mM NaOH的pH调节：（1ml8mM的NaOH需用0.1M或1MHEPES的量）Final pH0.1 M HEPES (l)Final pH1 M HEPES (l)8.4867.2238.2937.0328.01017.81177.5159DNA分离注意事项：1 酚相和相界面可在2-8保存过夜。2 悬于75%乙醇的样品可在2-8保存数月。3 溶于8mM的NaOH的样品可在2-8保存过夜。需要更长保存时间的话，要将pH调至7-8，并将EDTA浓度增至1mM。蛋白质分离技术指南蛋白质分离自用乙醇沉淀DNA之后的酚-乙醇相（DNA再沉淀第一步）。所的样品可以用于WB分析特异性蛋白。需要但无需补充的试剂：异丙醇0.3M盐酸胍溶于95%乙醇75%乙醇1%SDS1 蛋白质沉淀用异丙醇从酚-乙醇上清液（每1mlTRIZOL约加0.8ml）沉淀蛋白质。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加1.5ml异丙醇。在15-30下存储样品10分钟，2-8下以12000g离心10分钟沉淀蛋白质。2 蛋白质洗涤 除去上清，在含0.3M盐酸胍的95%乙醇中洗涤蛋白质沉淀3次。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加2ml洗液。每一轮洗涤时，将蛋白质存于15-30的洗液20分钟，并在2-8下以75000g离心5分钟。最后一次洗涤完成后。用2ml乙醇涡旋蛋白质沉淀。在15-30下保存乙醇中的蛋白质沉淀20分钟，并在2-8下以75000g离心5分钟。3 再溶解蛋白质 真空干燥蛋白沉淀5-10分钟。用移液枪将其溶于1%的SDS。彻底溶解蛋白质沉淀需要在50孵育。在2-8下以10000g离心10分钟沉淀所有不容物，将上清移至新管。所得样品可以用于WB或在-5到-20储存备用。蛋白质分离注意事项：1 悬于乙醇或含0.3M盐酸胍的95%乙醇的蛋白质沉淀可以在2-8下储存至少1月，在-5到-20下储存至少1年。2 以下备选方案可以获得更高的回收效率。在2-8下用0.1%SDS透析酚-乙醇上清3次，再以10000g离心10分钟。澄清的上清液可用于WB。3 只要SDS浓度低到不会产生影响（0.1%），就可以用Bradford定量蛋白。也可以用没有去垢剂影响，不依赖于A260/ A260的方法（微量的酚会造成蛋白质浓度结果偏高）。常见问题解决：RNA分离1每mg组织或1106培养细胞的RNA期望产率 肝、脾，6-10g 肾，3-4g骨骼肌、脑，1-1.5g 胎盘，1-4g上皮细胞（1106培养细胞），8-15g 成纤维细胞，5-7g2低产率 样品匀浆化或消化不完全 RNA沉淀再溶解不完全3A260/A280 1.65 分光光度分析前将RNA溶于水而，没有溶于TE 低离子强度和低pH溶液使280nm吸光值升高 样品匀浆化试剂的体积太小 样品匀浆化处理之后，没有在室温下存放5分钟 水相被酚相污染 最终RNA溶解不足4RNA降解 组织从动物体分离后没有立即处理或冷冻 用于分离的样品或分离得的RNA样品保存在-5到-20，而不是-70到-70 细胞被胰蛋白酶消化了 水溶液或管子含有RNase 在pH以下3.5，将甲醛用于琼脂糖凝胶电泳5DNA污染 样品匀浆化试剂的体积太小 用于分离的样品中含有有机溶剂（如乙醇、二甲亚砜）、强缓冲溶液或碱性溶液6糖蛋白或多糖污染 以下经过优化的RNA沉淀技术可以从分离RNA中除去这些化合物。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL加0.25ml高盐沉淀液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaOH），然后向水相加入0.25ml异丙醇。混合、离心，并按前述方案继续。该优化方案可以有效地沉淀RNA，而且可以使多糖和糖蛋白保持可溶状态。从含有大量多糖的植物组织中分离高纯度RNA时，就需要对开始的匀浆液进行改良的离心。DNA分离1每mg组织或1106培养细胞的DNA期望产率 肝、肾，3-4g骨骼肌、脑、胎盘，2-3