细胞培养步骤.doc

一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（25）105 cellsml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5CO2，37静置培养。一般35d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量12的新培养液，继续培养23d后换液，一般714d可以长满瓶壁，进行传代。4. 注意事项（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。 （2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。（3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。（4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。（5）L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。（6）静置培养：原代细胞在消化分离后，置于CO2培养箱的头2448h (必要时72h)内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖，初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成分会消耗光，在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。（7）消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。（8）其他生长因子：经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子，如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外，内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用，但费用较高。二、传代培养及其操作步骤原代细胞培养成功以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株)，可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。1. 操作步骤（1）吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。（2）向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。（3）置37孵箱或室温（25温度）下进行消化，25min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。（4）吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。（5）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。（6）用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。（7）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般23d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。2. 注意事项（1）掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。（2）掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。三、体内细胞培养及其操作步骤1 瘤细胞悬液接种 （1）无菌选取生长良好(有光泽，淡红色)瘤组织或对数生长期培养瘤细胞。 （2）在PBS中将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨，经80100目筛网过滤成细胞悬液。（3）培养细胞应用PBS洗两遍。（4）计数并调整细胞浓度至107108ml。（5）常规消毒后，于接种部位(通常为背部或腋窝腹股沟皮下)用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液(0.1ml部位，106细胞)。初次接种成功率低，细胞数尽可能多一些。（6）次日注意观察动物一般情况。初次接种一般有一段较长的潜伏期，以后随着传代潜伏期逐渐缩短，最后固定为一个相对稳定的时间。2 腹水瘤的建立与腹水瘤的接种将实体瘤细胞直接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤细胞，将这种腹水反复传代，即可成为腹水瘤。初次传代时，腹水常呈血性(含大量红细胞)，反复传代后腹水逐渐变成乳白色。腹水瘤的接种过程如下。（1）将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤，进行细胞计数。（2）消毒动物，左下腹穿刺接种106腹水瘤细胞。（3）接种腹水瘤细胞后约712d，待小鼠腹部明显膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9号针头抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽35ml。（4）抽取的腹水经3000rpm离心15min，收集上清，分装冻存备用。四、培养细胞的冻存及复苏细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。1 冻存细胞（1）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1d换液。（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5107ml左右密度，离心，去上清。（3）加入配制好的冻存液（小牛血清： DMSO=9：1，一般5106使用1ml冻存液（即900ul血清+100ul DMSO，先加血清再加DMSO，否则冻伤细胞），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。（4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液。（5）-20冰箱 4小时，再放入-70冰箱。（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1min的速度，在3040min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。2. 复苏细胞（1）从罐中取出冻存管。（2）迅速放入3637水浴，不时摇动，使其急速融化，3060s内完成。（3）冻存管用70酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。（4）低速离心(5001000rmin) 5min，去上清后再用培养液洗一次。（5）用培养液适当稀释后，装入培养瓶37培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。冻存细胞数量要充分，密度应达到107ml，在融后稀释20倍时，仍能保持5105ml数量。培养基的配制：实验步骤：在超净台内，安装好滤器。用去离子水溶解1640培养基，并用磁力搅拌器搅拌2 h，使之充分溶解。在超净台内过滤。分装到250 mL的玻璃瓶内。用封口膜封好，-20保存，过滤结束时，还要取少许培养基进行菌培，验证培养基是否是无菌。胎牛血清的处理：没有灭活的血清中含有补体成分，需要将血清在56条件下灭活30 min。在水浴锅内进行，灭活的过程中，要不停地摇晃，使受热均匀，防止沉淀析出来。注意：刚取出的冻存血清不要立即放入56中，因为突然的温度升高会使装血清的玻璃瓶破裂，应该放在室温逐渐溶解，然后，再进行灭活处理。生长培养基的配制：90 mL IMDM中加入大约10 mL的胎牛血清（10% 左右），双抗可以不加。(有资料表明双抗对细胞有一定的毒副作用)Hanks 和D-Hanks液，以及胰酶的配制Hanks液是一种常用的平衡盐溶液，D-hanks液是不含钙镁的Hanks液。它们与细胞的生长状况下的pH值和渗透压一致，细胞在Hanks液中可生存几个小时，Hanks液主要用于清洗细胞。D-Hanks液主要用于配制胰酶。配制Hanks液需将CaCl2溶于蒸馏水，再将其它试剂配制成溶液，将两次配制的溶液混合，定容。胰酶是一种常用的细胞消化液，在原代培养时，用胰酶消化，使细胞从组织块中游离出来。传代培养时，用胰酶消化贴壁的细胞，并分散成单个细胞。胰酶分离细胞的能力与不仅与胰酶作用的温度、时间、浓度和pH有关，还与细胞的类型和特性有关。用于原代培养消化组织块采用的浓度为：0.1% 或 0.125%；用于传代培养采用的胰酶浓度为：0.25%或者0.2%。胰酶的配制：1）由于胰蛋白酶的作用主要机制是通过螯合钙镁离子，而钙镁离子是保持细胞和细胞之间相互连接所必需的，所以，胰酶的配制用无钙镁的D-Hank液，避免钙镁离子干扰胰酶的活性。2）胰酶在pH8.0时活性最强，在过滤除菌前，须用NaHCO3干粉调溶液的pH值。3）胰酶受热容易分解，所以避免盛夏配制，在配制过程中，温度保持在4，最后-20冻存。反复冻溶会影响胰酶的活性，要分装冻存。4）血清能降低胰酶的活性，所以，在终止胰酶的消化反应时，可加入含有血清的培养基。实验步骤配制Hanks液，高压灭菌，4保存。称取胰酶，在冰浴上进行研磨，并加入少量的D-Hanks液，使其呈糊状，最后用D-Hanks定容，过滤除菌。分装后，-20保存。实验三、细胞传代培养实验步骤1、准备工作：1）肥皂洗手，在进行无菌操作前，用75% 的酒精擦拭双手，注意指间，和指甲周围。同时，用酒精棉球擦拭超净台。2）将培养液放置室温，备用。3）打开超净台内的紫外灯，照射20 min。同时，将实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）4）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。2、关闭超净台的紫外灯，打开风机。3、点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用。4、在打开培养瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再用吸管轻轻吸出旧的培养液，注意，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。5、将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失，变圆时，立即翻转培养瓶，吸出胰酶。记住不要消化时间过长，否则，细胞会被胰酶消化掉。6、加入适量Hanks液或培养基清洗一遍，立即倒掉。7、加入含有10%血清的培养基，用吹打管吹打，一定要轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，再补加培养基，按1:3进行分瓶。然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，放到培养箱中进行培养。以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法，对于悬浮细胞的传代培养方法，只需要将细胞进行离心，1000 rpm，5 min,然后，换入新的培养基即可。再分装到不同的培养瓶中进行培养。不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形，不规则，失去原有的特点。4. 是否污染：传代或换液24 48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞。实验四、细胞冻存与复苏实验步骤1. 为了保证细胞良好的状态，在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期，同时将细胞换液，次日，按照细胞传代培养方法，用胰酶消化贴壁细胞，将细胞用培养基冲下来，然后，用50 mL尖底离心管离心，1000 rpm，4min，弃上清，收集细胞。2. 加入适量的冻存液（10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培养基）3. 分装到冻存管中，做好标记，标明细胞名称，保存时间，所用培养基等。4. 4放置30 min；-20放置1.5 h； -70放置12 h；最后移到液氮罐中。细胞的复苏：细胞的复苏原则是快速溶化，因为如果缓慢的溶化，会使进入细胞的水分形成冰晶，对细胞造成伤害，因此，在复苏细胞时，将冻存细胞直接放到37的水浴中，使其迅速溶解。在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接倒入小培养瓶或培养皿内，然后，加入3 mL的培养液。次日，观察细胞生长情况，并更换细胞培养液。细胞培养是将器官、组织或细胞从生物机体中取出，模拟该器官、组织或细胞在机体内的生理条件，在体外进行培养