血细胞分析仪维修与开发技术.ppt

1 血细胞分析仪维修与开发技术 2 血液是维持人体正常生理活动的重要物质 它向全身各组织供应氧气 调节各器官的生理活动 抵御有害物质和病菌的侵害 常称为 生命之河 人类生理和病理的变化 往往会引起血液组份的变化 可为医生提供诊断与治疗疾病的重要依据 血细胞计数与分析就是了解血液组份的一种方法 它已成为各级医院进行血液常规检验的必做项目之一 3 1 血液的组成 特点及血细胞计数参数血液由血浆和血细胞组成 血浆是血液的液体部分 除了水分之外 还有许多化学物质 血细胞包括红细胞 白细胞和血小板 其中红细胞的数量最多 血浆的基本组成如下表 4 人类生理或病理的变化与血液组份的变化息息相关 及时了解血液组份的变化 可为疾病的诊断 治疗提供重要依据 血液由血细胞和血浆组成 血细胞包括红细胞 白细胞和血小板 其中血细胞计数是指计数单位容积中红细胞 白细胞和血小板的数量 是了解血液组份的方法之一 所谓血细胞计数主要是指计数单位容积中红细胞 白细胞和血小板的个数 红细胞在人体内的主要功能是携带氧气和部分二氧化碳 参与人体的气体交换 红细胞的数量最多 5 成人男子红细胞的个数为旧制4 2 6 2 106个 l 新制4 2 6 2 1012个 L 成人女子红细胞的个数为旧制4 2 5 4 106个 l 新制4 2 5 4 1012个 L 红细胞的直径在6 9 m之间 平均为7 2 m血红蛋白存在于红细胞内 是红细胞的主要成分 其功能是结合氧气或部分二氧化碳 正常参考值成年男性为 120一160g L 成年女性为 110 150g L 6 白细胞 被成为人体卫士 它可以防止外来微生物的侵害及其他感染 白细胞分5类 中性粒细胞 淋巴细胞 单核细胞 嗜酸性细胞和嗜碱性细胞 正常人的白细胞数目为旧制4 0 10 0 103个 l 新制4 0 10 0 109个 L 血小板有凝血和止血的功能 正常人的血小板数目为旧制1 0 3 0 105个 l 新制1 0 3 0 1011个 L 平均直径2 3 m 7 机体的某些病变 可通过血细胞计数反映出来 如贫血时 红细胞计数 血红蛋白浓度会低于正常参考值 化脓感染 急性炎症 组织坏死 肿瘤 急性失血时白细胞计数会高于正常参考值 病毒感染 某些药物或经常接触放射性物质会使白细胞计数低于正常参考值 又如 血小板低于 20 50 109 L会引起出血性疾病 而大于1 0 1012 L又易形成血栓 总之计数血细胞显得非常重要 临床上称之为血液常规 8 传统的人工计数是将血液稀释后滴在血细胞计数盘 在显微镜下肉眼观察 这种方法效率低 计数精度低 误差因人而异 通常在 5 10 之间 随着检验工作量的增加和对精度要求的提高 这种传统方法远不能满足实际工作需要 50年代 随电子工业和计算机技术的发展 细胞计数器便应运而生 细胞计数器是实现细胞计数的一种仪器 初期的计数器只计数红细胞 白细胞 称细胞计数器 CellCounter 后来增加了一个光电比色系统测定血红蛋白 9 随着电子计算机的普及 发展和应用 细胞计数器的分辨能力进一步提高 除了红细胞 白细胞计数外还可以对血小板进行计数 还能计算出红细胞指数 共可得到8个参数 称全血计数 Completebloodcount CBC 随着特殊溶血剂的应用 能将白细胞按体积分为2 3分群 即淋巴细胞 粒细胞和中间细胞群 这样 细胞计数检测的项目可多达18项 甚至在实现白细胞五分类后 细胞分析的参数多达20多项 由以前简单的细胞计数器成为名符其实的血细胞分析仪 hematologyanalyzer 10 近年随着激光技术的应用 令血细胞分析的工作原理从单纯的电阻法得到突破性的进展 出现了能进行多参数相关测量的流式细胞仪 它可测量细胞多项生化成分 如核酸 蛋白质 膜成分 酶活性等等 在基础医学与临床医学上有着广泛的应用 2 细胞计数器人们研究血细胞的计数问题时 其计数原理曾采用过变阻脉冲法 光电计数法 激光计数法等 11 现在 因前者简单实用而被普及 仪器测量的细胞数量比手工方法在显微镜下测量的细胞数量要多约100倍 统计误差减少了约90 提高了计数的精确度 3 变阻脉冲法原理1 变阻脉冲法血细胞计数原理变阻脉冲法血细胞计数原理简称电阻法原理 是美国科学家库尔特 W H Coulter 1947年首先提出来的 故又称库尔特原理 电阻法计数在大多数细胞计数器中是利用小孔管换能器装置来实现的 如图1 1所示 12 13 小孔管是在一块25 50 m厚的红宝石或蓝宝石上打一小孔 然后将其粘接在一支玻璃管上而制成 小孔直径多为100 m或75 m 单独用来测试血小板的小孔管 其孔径还要再细些 小孔多位于管底的侧面 所能测试的颗粒大小为小孔直径的2 40 这样 100 m的小孔可以测2 40 m大小的颗粒 小孔管内外各置一根铂金电极 两电极间施加一个恒定的电流 当小孔管里加入电解液 并将其置入装有相同电解液的样品杯中时 两电极之间便产生一个恒定的电流 14 测试时 先将待测血液用洁净的电解液充分稀释 使血细胞在电解液中成为游散状态 然后在小孔管上端加上负压 在负压的抽吸下 混有血细胞的电解液便被均匀地抽进小孔管 血细胞为电的不良导体 当它通过小孔的瞬间 取代了同体积的电解液 从而改变了2个电极之间的电阻 如图1 2为单个细胞通过小孔时引起电路中电阻变化的情况 15 16 在电流恒定的情况下 电阻的改变会引起电压的变化 在前一个血细胞通过小孔 下一个血细胞还未靠近小孔时 电极间的电阻又恢复正常 这样血细胞连续地通过小孔 就在电极的两端产生一连串电压脉冲 脉冲的个数与通过的细胞个数相当 体积不同的细胞其电阻率不同 产生脉冲的大小也不同 幅度与细胞体积成正比 如图1 3给出不同体积细胞通过小孔时产生的电压脉冲 将这些脉冲加以放大 鉴别 整形以后送到计数电路计数 便可计得细胞的个数 17 18 2 血细胞的分别计数原理细胞的分别计数是指分类计数各种血细胞 血液中各种细胞的体积是不同的 白细胞体积范围在120 1000 m3 红细胞在85 95 m3 血小板在2 30 m3 血细胞的分别计数便是利用它们的体积及数量的不同 由前述可知 体积不同的红细胞 白细胞 血小板 其产生的脉冲幅度也不同 排列顺序以白细胞最大 红细胞次之 血小板最小 在计数红 白细胞时 可利用一个幅度鉴别电路将血小板筛选掉 这个鉴别电路叫阈值选择电路 如图1 4所示 阈值电压选择在U1时 只有红 白细胞产生的脉冲参与计数 阈值电压选在U2时 血小板产生的电压脉冲才能参加计数 最下面的小信号为干扰脉冲 19 20 1 红细胞计数 正常人体外周血红细胞的数目为白细胞的1000倍左右 当阈值电压选在U1时 白细胞产生的脉冲个数较红细胞产生的脉冲个数少得多 几乎可以完全忽略 红 白细胞数可视为红细胞数 2 血小板计数 将阈值电压选在U2时 可以去掉干扰计数 并计出红 白细胞和血小板的总数 最后从总数中减去红 白细胞数 即为血小板数 21 3 白细胞计数 在计数白细胞时 先在稀释血液中加入一种溶血剂 使红细胞溶解破碎 其碎片体积分散到不影响白细胞计数的程度 红细胞破碎后 将阈值电压选在U1 再对剩下的白细胞产生的脉冲个数进行计数 便可以求得白细胞数 红细胞破碎溶解后 其内部的血红蛋白便释放出来 与溶血剂中的转化剂反应进而转化为颜色稳定的氰化血红蛋白 通过光电比色法可求出血红蛋白的含量 22 3 细胞直方图与白细胞分类目前三分类以上细胞计数器均在给出各细胞参数的数据结果时 同时提供3种细胞 红细胞 白细胞和血小板 的细胞体积分布图 并以体积为横坐标 以细胞的相对数量为纵坐标 把细胞在一个个很小的体积范围 又称通道 频道 内的数量分布情况表达出来 我们称之为直方图 histogram 通过细胞直方图我们可形象直观地获得细胞体积分布的特征 另外白细胞直方图尚可用于白细胞亚群的分类 直方图是由测量通过感应区的每个细胞脉冲积累得到的 在计数的同时进行分析测量 如图1 5为典型红 白细胞及血小板直方图 23 24 25 26 直方图的X轴以fl为体积单位 其数值设定与该细胞的大小有关 以血小板的设定最小 白细胞最大 Y轴以细胞相对数量为单位 当细胞数量过少而引起直方图曲线偏低时 计数器会自动在Y轴方向按比例放大 抬高曲线 1 红细胞直方图 红细胞直方图如图1 5a 体积分布曲线的显示范围从24 360fl 计数器把大于36fl的颗粒计数为红细胞 可得到2个细胞群体 红细胞主群 从50fl偏上开始有一个呈正态分布曲线 又称 主峰 小细胞群 位主群右侧 又称 足趾部 是一些多聚体细胞 白细胞 小孔残留物等 27 2 血小板直方图 血小板直方图如图1 5b 典型血小板直方图呈对数正态分布 显示范围0 36fl 计数范围为2 20fl 3 白细胞直方图与白细胞分类 如图1 5C 白细胞体积分布曲线的显示范围是30 450fl 如前述 白细胞计数时先加溶血剂将红细胞溶解后再计数 溶血剂不仅破坏红细胞 还作用于白细胞 使其膜表面产生小孔 致细胞失水皱缩 此时细胞大小实际上是细胞核与胞浆中颗粒成分之和 经过溶血剂的化学处理 各群白细胞体积有所改变 28 大小大致为 淋巴细胞 单核细胞 粒细胞 在直方图上表现为3个白细胞亚群 35 90fl范围的淋巴细胞群 LY 可以包括淋巴细胞 91 160fl范围的单核细胞群 MO 可以包括单核细胞 幼稚细胞 161 450fl范围的粒细胞群 GR 可以包括嗜酸性细胞 嗜碱性细胞 中性粒细胞 计数器根据3个体积范围内的颗粒数与总颗粒数之比例 便可计算出白细胞三分类 即 LY 35 90fl范围的颗粒数 3 450fl范围的颗粒数 MO 91 160fl范围的颗粒数 3 450fl范围的颗粒数 GR 161 450fl范围的颗粒数 3 450fl范围的颗粒数 29 这种分类方法叫直方图分类法 计数器直方图分类与人工染色显微镜分类比较 相关系数为 LY 0 9 MO 0 7 GR 0 9 正常细胞分类的可信度达95 不需人工复查 白细胞直方图除显示分类外 还显示4个报警区域 如果某个报警区域里的计数值异常增多 就在此区域出现 R 报警 R1为直方图上淋巴峰左侧区域有异常 可能有血小板凝块 巨大血小板 有核红细胞 不溶性红细胞和冷凝集素等因素的影响 R2为直方图上淋巴峰和单核峰之间的区域有异常 可能有异型淋巴细胞 幼稚淋巴细胞 浆细胞 嗜酸性细胞或嗜碱性细胞等因素的影响 30 R3为直方图上单核峰和中性粒峰之间的区域有异常 可能有不成熟粒细胞 嗜酸性细胞等因素的影响 R4为直方图上中性粒峰右侧区域有异常 粒细胞数量过多 RM为以上区域2个或2个以上同时有异常 分类报警的实验前因素有 试剂污染 试剂不配套 样品没有混匀 血样存放时间太长和电噪声等 4 定量原理定量装置是为了对一定容积的血细胞进行计数而设计的 可确保被计量样品液容积的精度 31 4 定量原理定量装置是为了对一定容积的血细胞进行计数而设计的 可确保被计量样品液容积的精度 1 定量装置分类 定量装置可分为有水银压力计式和无水银的光电检测式2种 前者系早期产品 由于水银的挥发性和毒性 使用不当易造成污染和公害 80年代后逐渐采用光电检测式定量装置 光电检测式定量装置常用的有多种形式 图1 6是其中的一种 32 33 计数时 样品液在负压吸引下通过小孔进入小孔管 当液面沿管路上升到P3点时 弯曲的液面使发光管发出的光线折射 电检测器便产生一个脉冲信号去控制电路令计数开始 当液面上升到P1点时 又产生一个脉冲信号令计数停止 P1和P3之间的容量便等于进入小孔管被计数的样品液容量 2 定量装置中的特殊部件 定量装置中的特殊部件主要有负压泵 压力调节器和废液瓶 34 负压泵 是管路系统中的动力部件 样品液 电解液 清洗液等均靠负压抽吸流动 在计数时 尤其要求稳定而适当的负压以避免计数误差 负压泵常以电磁感应原理为设计基础 故又称为电磁泵 结构有多种种形式 图1 7是其中的一种 35 36 图1 7它由电磁铁 永久磁铁 气囊等组成 波纹管的左端有一块永久磁铁 永久磁铁左边是电磁铁 当电磁铁的极性与永久磁铁的极性相反时 便对永久磁铁产生吸力 即将永久磁铁吸引过去 永久磁铁带动波纹管舒张 使得进气阀打开 排气阀门关闭 波纹管向气囊内抽气 当电磁铁的极性和永久磁铁的极性相同时 在电磁铁的排斥和波纹管本身收缩力作用下 气囊压缩 使排气阀门打开 进气阀门关闭 抽进气囊里的气体被排出去 37 由以上工作原理可知 当抽气口接负压瓶时 便可以组成负压泵 当排气口接压力瓶时 它便成为正压泵 压力调节器各种细胞计数器所需要的最佳负压范围有所不同 即使同一台仪器因使用环境不同 管路状况不同也可能造成负压偏离 因此需要负压调节器给予一定的调节 常见的负压调节器有手动和自动式2种 自动式压力调节器之一的工作原理如图1 8所示 38 39 1只压敏电阻和一只可调电阻与2只普通电阻构成桥式电路的4只臂 其中压敏电阻与负压相通作为工作臂 可调电阻用以调节负压的大小 当电桥平衡时R1 R2 R3 R4 桥路不输出信号 即输出为零电平 当负压变化时 R1的阻值发生变化 桥路失衡 将有信号输出 这个信号可正可负 接到控制电路后便将负压控制在额定范围之内 废液瓶废液瓶的作用有3 一是使负压泵产生的压力通过它作用到小孔管内的液体上 二是对负压泵产生的负压有缓冲作用 三是存贮废液 不让废液进人负压泵 如图1 9所示 40 41 废液瓶可用玻璃或塑料制成 瓶盖和瓶体需紧密接触 因为废液瓶是负压的容器 气密不良便不能正常工作 瓶盖上有2根管子 分别连接定量管和负压泵 瓶盖上还设计了废液报警装置 当废液将满时 浮动开关上浮 驱动报警信号灯闪烁 当废液报警时 操作者必须及时将废液倒掉 否则将可能损坏泵体 有的机器具有自锁功能 即废液瓶将满时不但发出警告信号 而且锁住机器不能进行任何操作 42 5 计数器上的一些重要技术为保证计数的准确性 许多计数器应用了以下重要技术 1 燃烧电路 该电路能灼烧小孔 自动清洁屯积在计数孔的蛋白质 防止计数孔堵塞 2 重合损失补偿 细胞计数时 理想状态是让细胞一个个地通过宝石微孔 但是红细胞直径平均为7 10 m 白细胞直径平均为25 m左右 而微孔直径有75 100 m 实际计数时会有2个或2个以上的细胞重叠一起进入小孔 感应区 这种情况产生的脉冲幅度会比单个细胞要高 但只能产生一个信号脉冲 使计数有所丢失 也即计数假性降低而体积会假性升高 这种现象称为重合损失 43 出现重叠的概率与细胞浓度 液体流速和孔径有关 为了弥补这种损失 电路中设有重合校正电路或用软件校正 通常是按伯桑 Poisson 分布规率加以校正 校正规律是 计数值在8000一下不校正 计数值在8000 38000时 每计数1000个含补充的100个数 即在这个范围内 计数电路每计数900个便向千位进1 在38000以上时 每计1000含补充的200个 即在38000以上 计数电路每计数800个便向千位进1 经重合校正后的计数结果更接近真实值 44 3 3次计数 计数器在计数细胞时 对主要参数如红细胞 白细胞 血小板及细胞体积均作3次计数 若3次计数结果的离散度在一定范围内则取3次计数的平均值报出 若有其中一次计数与另2次相差偏大 则该次计数被赋予警报 只报告另两次计数的平均值 若3次计数结果均相差大 则无结果报出 4 延长计数 当所计数的细胞少于界定的数量时 计数器会自动延长计数时间 即重复计数 以保证相当的统计量 减少统计学误差 确保报告结果的准确度和精密度 45 5 脉冲编辑 当细胞通过小孔的电阻感应区时 由于所经途径不同 产生的脉冲幅度会有所变化 对体积测量有一定影响 可通过脉冲编辑技术修正这种影响 6 高频道分析 为达到高分辨和高精度 计数器在25 450fl范围内 分256个体积段 频道 分析白细胞 在36 360fl范围内分256个频道分析红细胞 在2 20fl范围内分64个频道分析血小板 使细胞分析达到最佳效果 新型的计数器不但计数红细胞 白细胞 且计数血小板 为保证计数准确 精密 除应用上述技术外还增加了以下的一些技术 46 7 拟合曲线 血小板计数时 为了排除2fl以下电子噪声与杂质干扰和2fl以上小红细胞与其他小细胞的干扰 计数器设定在2 20fl范围内计数血小板 然后再根据正常人血小板体积分布符合对数正态分布的理论 通过0 70fl的电子拟合曲线将没有被直接计入的血小板间接计入总数内 以减少血小板计数时所受的干扰 8 扫流技术 血小板和红细胞在同一个计数池计数 若红细胞经过小孔后发生回流 只要稍微触及小孔感应区 电极就可能感应到相当于血小板大小的小脉冲 使血小板计数假性升高 计数器在小孔后侧安装一个液流装置 可随时将经过小孔后的细胞冲走 消除红细胞可能的回流对血小板计数的影响 47 9 血小板延长计数 细胞计数时 当血小板浓度小于6 7 1010 L 而红细胞浓度大于10 1012 L时 仪器会自动延长计数时间 以保证达到一定的血小板统计量 提高计数准确度 减少统计学误差 4 血红蛋白测定原理在稀释血液中加入定量的溶血剂 快速溶解红细胞 并将释放出来的血红蛋白全部转变成稳定的氰化血红蛋白 后者对540nm波长的光吸收量与血红蛋白浓度成正比 即血红蛋白含量愈高 吸光性愈强 通过比色 用光电器件检测透射光强度 即可得到该样品血红蛋白浓度 很多计数器的光路系统为了防止光散射和外来光干扰 常用双波长法测量 光路如图1 10所示 48 49 光源发出的光经透镜和狭缝到达流动比色皿上 透过流动比色皿再到达一个半透半反镜上分成一束透射光和一束反射光 透射光经过690nm滤光片到达一光电池 被光电池转换为参考信号 另一束反射光经过540nm的滤光片到达另一光电池 被光电池转换为样品信号 在540nm的吸光度为 A540 K540 C L A540干扰式中 A540为在540nm时的吸光度 K540为在540nm时的吸光系数 C为待测物质浓度 L为吸收池厚度 50 A540干扰为光散射和背景吸光度 同样 对于690nm的吸光度也有 A690 K690 C L A690干扰因参比信号和样品信号是在相同的环境下获得的 因此可以把A540干扰和A690干扰视为相等 因此透过比色皿的参考信号和样品信号的吸光度之差 A为 A K690 K540 C L即样品中待测组分的浓度与两波长的吸光度之差成正比 故在电路中求出参考和样品两信号之差 便可以求得相应的血红蛋白浓度 并有效消除和减少了光散射 背景吸收以及混浊样品等因素对测定的影响 51 5 细胞计数器的配置5 1试剂系统细胞计数器的生产厂家都有配套的试剂系统 包括有稀释剂 溶血剂 清洁剂 质控品 定标液等 1 稀释剂作用 稀释血液并保持细胞的生物学特性 完整性和原有体积 维持小孔导电 冲洗管道及标本流程 52 2 溶血剂作用 快速溶解红细胞 使其释放出血红蛋白 将血红蛋白全部转变成稳定的氰化血红蛋白 使白细胞一定程度的皱缩 控制分类 为进行正确的白细胞分类 溶血剂必须与配套的稀释剂配合使用 以上2种试剂若受震荡 如将剩余试剂合并一起或试剂在运输后 会激起大量微小气泡 影响空白计数结果 应静置3天以上再使用 3 清洁剂作用 去除计数管道中的血液残余成分 53 5 2仪器安装放置与保养血细胞计数器属精密电子仪器 安装放置及日常的维护保养十分重要 1 安装放置 安装时一般有厂家工程师来 注意仪器应安装在近电源 有排水处 安装时应断开电源 仪器四周留有空间便于维护和检修 试剂 废液桶要置于低于仪器的水平面 以免液体回流到真空管损坏仪器 各种试剂 稀释剂 溶血剂和清洁剂 及废液桶与仪器的管道连接无误 且废液排放应遵守当地规定 仪器安装好 应用定标液校正后方可开展日常工作 仪器在维修或搬动后应用质控液 定标液加以调校 54 l 放置环境要求 室温15 35 湿度10 90 避免阳光直射 由于计数器为颗粒计数 故放置环境应十分洁净 避免灰尘影响计数及造成电路板短路 防电磁 噪声干扰 计数器应远离冰箱 离心机 X线机 CT机 磁共振等强磁干扰的仪器 并建议加装UPS辅助电源 同时要求电源接地线良好 地线电压小于0 5伏 2 保养 一般要求专人保养 使用人员上机前要仔细阅读仪器说明书及接受良好的培训 做到对仪器的原理 操作规程 使用注意事项 55 报告的含义 维修保养 及引起实验误差的因素有充分了解 严格执行仪器的每日 每周 每月保养规定 计数细胞最重要的部件为小孔管 血液中某些物质及细胞碎片常因小孔管不常清洗而附于小孔管壁上 时间长了易发生堵孔 现在许多计数器均设有 燃烧 电路 启动后可自行消除小孔上的蛋白质 但小孔管还须每日清洁保养 可使用含蛋白酶的清洁剂浸泡 一般每日应浸泡0 5h以上 但不超过48h以免损伤管道 长时间 2天以上 停机应在浸泡清洁剂后用稀释剂冲洗干净管道 再以稀释剂浸泡 每周 每月用10 次氨酸钠溶液浸泡小孔管 冲洗管道 56 5 3标本采集标本的采集可分末梢采血和静脉采血2种 分别用于半自动及全自动的计数器 1 末梢采血 一般先准备好定量的稀释剂 采微量手指血于稀释剂中混匀 称预稀释 采血时用棉球消毒应注意棉花纤维不要混入稀释剂中 以免上机测试时发生堵孔 2 静脉采血 可用专用抗凝试管或自备试管 前者用于自动进样系统 后者用于手动进样 6 细胞计数器的发展 57 现代科技一日千里 细胞计数器得益于各种新技术的介入发展很快 主要表现如下 1 测试原理的发展 主要表现在对白细胞分类的改进 细胞计数器研制初期 是无细胞分类的 后来先后出现过二 三分群 都基于电阻法测量细胞大小这一分类原理 但这不能将嗜酸 嗜碱性细胞与其他细胞分开 不能实现5项分类 如中性粒细胞与嗜酸性细胞在二维的直方图上就有许多重叠 必须增加新的方法以资鉴别 增加的新方法主要有激光散射法 高频电磁波法 又称射频法 及细胞化学染色计数等 58 激光散射法 lightscatter 细胞经过激光区域时 由于不同细胞其表面特性 内部结构及颗粒均不同 对光的散射各异 从不同角度 如以00 10o和90o 测得散射光强度会因细胞不同而有差异 射频法 ratiofrequency RF 细胞体积大小 内部结构的差异可影响高频电磁波对其