DNA的粗提取与鉴定课件.ppt

粗提取与鉴定 DNA 实验材料的选取 材料 鱼卵 猪肝 菜花 花椰菜 香蕉 鸡血 猕猴桃 洋葱 豌豆 菠菜 在液体培养基中培养的大肠杆菌原则上 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 但是 选用DNA含量相对较高的生物组织 成功的可能性更大 鸡是真核生物 真核生物的DNA都在染色体上 鸟类的血细胞核大 DNA多不需要破除细胞壁问题 鸡血细胞液在取材之后 到实验前 是否需要特殊处理吗 柠檬酸钠抗凝 问题 鸡血细胞虽然没有细胞壁 但是依然有细胞膜 以你所学的知识 有什么比较简便但是可行的方法可以破碎细胞膜 答 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体 水分可以大量进入血细胞内 使血细胞胀裂 再加上搅拌的机械作用 就加速了鸡血细胞的破裂 细胞膜和核膜的破裂 从而释放出DNA 1 动物细胞动物细胞的破碎较易 例如 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 同时用玻璃棒搅拌 过滤后收集滤液即可 讨论 为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂 对于动物细胞我们可以利用细胞的渗透压来破碎细胞 但是很多情况下 人们不得不面对植物材料 那么我们是不是还可以通过加入一定量的蒸馏水来涨破细胞呢 洗涤剂的作用 洗涤剂也分为亲水基团和亲脂基团 可以与细胞膜中的蛋白质结合 使之溶解 进而瓦解细胞膜 食盐的作用 食盐中主要含有NaCl 有利于DNA的溶解 过滤 用3 4层纱布对DNA稀释液进行过滤 滤过蛋白质 收集DNA的粘稠物 问题 这时的滤液可能含有哪些细胞成分 主要有DNA RNA 核蛋白 多糖等我们应该如何将DNA单独分离出来 DNA溶解在浓度较高的NaCl溶液溶液中 DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点 选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解 而使杂质沉淀 或者相反 根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图 思考在什么浓度下 DNA的溶解度最小 DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的 在NaCl溶液浓度低于0 14mol L时 DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低 在0 14mol L时 DNA溶解度最小 当NaCl溶液浓度继续增加时 DNA的溶解度又逐渐增大 如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出 当氯化钠的物质的量浓度为2mol L时 DNA的溶解度最大 浓度为0 14mol L时 DNA的溶解度最低 利用这一原理 可以使DNA在盐溶液中溶解或析出 用高浓度的盐溶液溶解DNA 能除去在高盐中不能溶解的杂质 用低盐浓度使DNA析出 能除去溶解在低盐溶液中的杂质 缓慢贴壁加入蒸馏水 并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌 以利于DNA分子的附着和缠绕 同时应注意控制加水量 使NaCl溶液的终浓度为0 1 0 2mol L 直到溶液中丝状物不再增加时为止 方案二 直接在滤液中加入嫩肉粉 反应10 15min嫩肉粉的主要成分是木瓜蛋白酶蛋白酶能分解杂质蛋白 但对DNA没有影响 从而使提取的DNA与蛋白质分开方案三 将滤液放在60 75 的恒温水浴箱中保温10 15min 大多数蛋白质不能忍受60 80 的高温 而DNA在80 以上才会变性利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同 从而使蛋白质变性 与DNA分离 DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精 利用这一原理 可以将DNA与蛋白质进一步分离 预冷的酒精 可以促进DNA的凝集 将DNA粘稠物再溶解 继续用2mol L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物 仍旧沿一个方向不停搅拌3min 使DNA充分溶解 过滤 用3 4层纱布进行过滤 滤去杂质 收集含有DNA的滤液 纯化 向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积份数为95 乙醇 并用玻璃棒朝一个方向缓慢 均匀地搅拌 溶液中会出现DNA丝状物 DNA的鉴定 DNA遇二苯胺 沸水浴 会变蓝 因此 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 溶解 在物质的量浓度为2mol L的NaCl溶液5mL 放入丝状物 用玻璃棒搅拌 使之溶解 显色 加入4mL的二苯胺试剂 混合均匀后 将试管置于沸水中加热5min 问题 如果溶液变蓝是否能说明DNA的存在 设置对照组 除了可以使用二苯胺法 还有什么方法可以鉴定DNA 用甲基绿溶液直接滴在有DNA丝状物的载玻片或玻棒上 呈绿色反应 小结 在NaCl溶液浓度低于0 14mol L时 DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低 在0 14mol L时 DNA溶解度最小 当NaCl溶液浓度继续增加时 DNA的溶解度又逐渐增大 DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精 利用这一原理 可以将DNA与蛋白质进一步分离 蛋白酶能水解蛋白质 但是对DNA没有影响大多数蛋白质不能忍受60 80 C的高温 而DNA在80 C以上才会变性洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜 去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 小结 小结 DNA遇二苯胺 沸水浴 会变蓝 因此 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 实验操作小结 制备鸡血细胞液 加柠檬酸钠 静置或离心 破碎细胞 释放DNA 加蒸馏水 同一方向快速搅拌 过滤 除去细胞膜等 溶解核内DNA 加入NaCl至2mol L 同一方向缓慢搅拌