RNA干扰技术及应用.ppt

RNA干扰技术及应用 第一讲 本章内容 1RNAi的发现2RNAi机制3siRNA的设计4制备siRNAs的方法5RNAi技术的应用 研究的早期线索早在20年前 来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组 Rich orgensen和同事 在对矮牵牛 petunias 进行的研究中有个奇怪的发现 他们设想将更多的色素基因注入矮脚牵牛植物体中 试图加深花朵的紫颜色 而结果出其预料 转基因的植株不仅没有新基因表达 反而使原有的色素基因也受到了抑制 Jorgensen将这种现象命名为共抑制 cosuppression 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制 第一节RNAi的发现 第一节RNAi的发现 1995年 康乃尔大学的研究人员GuoS等试图阻断秀丽新小杆线虫 C elegans 中的par 1基因的表达 设计 反义RNA 特异性地阻断par 1基因的表达 正义RNA 以期观察到基因表达的增强 结果 二者都同样地切断了par 1基因的表达途径 这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合 该研究小组一直没能给这个意外以合理解释 1RNAi的提出 直到1998年2月 FireA和MelloC才首次揭开这个悬疑之谜 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现 基因抑制效应变得十分微弱 而经过纯化的双链RNA却正好相反 能够高效特异性阻断相应基因的表达 他们证实 GuoS博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象 以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断 都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起 该小组将这一现象称为RNA干扰 RNAinterference 简称RNAi 2RNAi广泛存在于自然界 随后 RNAi现象被广泛地发现于真菌 拟南芥 水螅 涡虫 锥虫 斑马鱼等大多数真核生物中 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段 随着研究的不断深入 RNAi的机制正在被逐步阐明 而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具 RNAi也越来越为人们所重视 2RNA干扰技术获奖 2001年被 Science 杂志评为十大科学进展之一 2003年再次被 Science 杂志评为十大科学进展之一 美国科学家FireA和MelloC因为发现RNA干扰机制而获得2006年度诺贝尔生理学或医学奖 安德鲁 菲尔和克雷格 梅洛 4RNA干扰概念 RNA干扰 是指双链RNA诱导同源mRNA降解从而导致基因表达抑制的现象 又称为基因沉默 RNA干扰是由双链RNA引起的 广泛存在于动物植物中的转录后序列特异性基因沉默过程 是生物体在进化过程中抵御病毒感染的保护机制 利用RNAi的这种特性 可以设计与已知基因mRNA同源的小干扰RNA siRNA 导入细胞或动物体内 使特定基因表达沉默 4RNA干扰概念 体外实验表明 RNAi反应中 加入的dsRNA被切割为21 23核苷酸长的RNA片段 后者会导致目的mRNA被切割为21 23核苷酸长的片段 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中 Hammond等人部分纯化了一种核酸酶 该核酸酶具有序列特异性 它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢 由于在纯化该核酸酶时 可以共分离出21 23核苷酸长的dsRNA片段 这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的 根据以上的实验结果 人们提出一种RNAi作用的简单模型 第二节RNAi作用的机制 第一步起始阶段第二步效应阶段 第一步起始阶段 当dsRNA导入细胞后 被一种称为Dicer的核酸酶 RNA酶 家族中一员 特异识别 切割成21 23核苷酸长的双链小片段 smallinterferingRNA siRNA Dicer酶能够逐步切割由外源导入或由转基因 病毒感染等各种方式引入细胞的dsRNA short interferingRNA 加工长链dsRNA形成21 23nt小片段 Tuschl 2001 第二步效应阶段 双链siRNA与一种核酸酶复合体结合从而形成RNA诱导的沉默复合体 RNA inducedsilencingcomplex RISC 每个RISC包含1个siRNA和1个不同于Dicer的RNA酶 第二步效应阶段 siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链 RISC被活化 活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA 识别之后 mRNA与dsRNA的有义链发生链互换 原先dsRNA中的有义链被mRNA代替 从酶 dsRNA复合物中释放出来 而mRNA则处于原先的有义链的位置 第二步 效应阶段 由RISC中的核酸内切酶作用 开始对靶mRNA切割 这样又产生了21 23核苷酸长的dsRNA小片段 dsRNA小片段可以与核酸酶形成复合物 继续对目的mRNA进行切割 从而使目的基因沉默 从而干扰基因表达 产生RNAi现象 RNA干涉机理图 RNA干涉机理图 RISC RNA InducedSilencingComplex Exonuclease Homologysearchactivity Endonuclease Helicease 5 3 形成RISC复合物 降解目的mRNA RISC由siRNA 解旋酶 ATP 核酸内切酶 核酸外切酶等多种成分组成 2RNAi的放大效应机制 1 siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA 而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶 RdRP 作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA 2 新合成的长链dsRNA同样可被RNase 样核酸酶切割 降解而生成大量的次级siRNA 3 次级siRNA又可进入合成 切割的循环过程 进一步放大RNAi作用 4 经过若干次合成切割循环 沉默信号就会不断放大 3RNAi研究的一般技术路线 靶基因 欲沉默基因 siRNA 小分子干扰RNA smallinterferingRNAs siRNA是一种短片段双链RNA分子 能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA 这个过程就是RNA干扰途径如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题 第三节siRNA的设计 一般设计原则 1 从mRNA的AUG起始密码开始 寻找 AA 二连序列 并记下其3 端的19个碱基序列 作为潜在的siRNA靶位点 有研究结果显示GC含量在30 50 左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效 2 将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较 排除那些和其他编码序列同源的序列 3 选出合适的目标序列进行合成 通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA 以找到最有效的siRNA序列 4 一个完整的siRNA实验应该有负对照 作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成 但是和靶序列mRNA没有明显的同源性 目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括 化学合成 体外转录 长片段dsRNA经RNase 类酶降解 siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNA PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 第四节制备siRNAs的方法 化学合成是成本最高的方法 也是最方便的 研究人员几乎不需要做什么工作 许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA 设计好的siRNA中通常只有大约25 的siRNA能高效抑制基因的表达 抑制效率 80 因此针对1个基因一般至少要合成合成3 4对siRNA 比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成 最适用于 已经找到最有效的siRNA的情况下 需要大量siRNA进行研究 不适用于 筛选siRNA等长时间的研究 主要原因是价格因素 1 化学合成 2 体外转录 相对化学合成法而言成本比较低 是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法 能够更快的得到siRNAs 体外构建双链RNA 分别在体外转录出正义和反义RNA 再用两者退火形成双链RNA 体外合成的双链RNA可以用脂质体转入细胞中 最适用于 筛选siRNAs 特别是需要制备多种siRNAs 化学合成的价格成为障碍时 不适用于 实验需要大量的 一个特定的siRNA长期研究 Figure UseofChemicallySynthesizedandinVitroTranscribedsiRNAstargeting ActintoInduceGeneSilencing 3 用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA 这个方法是通常选择200 1000碱基的靶mRNA为模版 用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA 然后用RNaseIII orDicer 在体外消化 得到一众siRNA 混合鸡尾酒 在除掉没有被消化的dsRNA后 这个siRNA混合物就可以直接转染细胞 方法和单一的siRNA转染一样 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNA 通常能够保证目的基因被有效地抑制 这种方法的缺点就是有可能引发非特异的基因沉默 特别是同源或者是密切相关的基因 4 siRNA表达载体 多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶 启动子 pol 中的一种 操纵一段45 50bp的短发夹RNA smallhairpinRNA shRNA 在细胞中的表达 shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA 从而引发基因沉默或者基因表达抑制 采用RNApol 启动子的原因是由于它有明确的启始和终止序列 总是在离启动子1个固定距离的位置开始转录合成RNA 遇到4 5个连续的U即终止并且转录产物在第2个尿嘧啶处被切下来 非常精确 而且还可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA 4 siRNA表达载体 转录出的RNA形成发卡样结构后 会在3 端形成2个突出的尿嘧啶 这类似于天然的siRNA 因而有利于双链RNA诱发RNAi 在长期稳定表达载体的细胞株中 双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用 是唯一可以进行长期研究的方法 短发夹RNA 商品化载体的siRNA策略示意图 短发夹RNA sm 短发夹RNA 5 siRNA表达框架 siRNA表达框架 siRNAexpressioncassettes SECs 是一种由PCR得到的siRNA表达模板 能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中 siRNA表达框架包括1个RNApol 启动子 一段发夹结构siRNA 1个RNApol 终止位点 与siRNA表达载体不同的是 SECs不需要载体克隆和测序等颇为费时步骤 可以直接由PCR得到 耗时不到1d 因此 SECs成为筛选siRNA的最有效工具之一 第五节siRNA转染细胞和RNAi的效果分析 siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制 因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤 例如 一个siRNA对某个特定基因表达的抑制效率是90 但是其转染效率只有10 那么总的抑制率只有9 目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想 直接注射裸siRNA或表达siRNA的质粒 病毒感染体细胞等 1转染细胞 2 RNAi的效果分析 可从靶基因mRNA和靶基因产物蛋白质两方面进行 mRNA RT PCR 定量PCR Northern杂交等 蛋白质 Western杂交 ELISA 免疫荧光等 第六节RNAi技术的应用 例1应用RNA干扰技术降低玉米支链淀粉含量淀粉是玉米籽粒的主要成分 根据其分子结构分为直链淀粉和支链淀粉两种 直链淀粉是重要的工业原料 在轻工业 食品工业 制药业生产等领域具有十分广阔的用途 玉米高比例直链淀粉也是生产光解塑料的最佳原料 是解决目前日益严重的 白色污染 的有效途径 淀粉分支酶是支链淀粉生物合成过程中的一个关键酶 它催化葡萄糖以 1 6 键连接 形成分支结构 1RNAi技术在食品领域应用 1应用RNA干扰技术降低玉米支链淀粉含量 RNA干扰 RNAinterference RNAi 技术提供了直接有效的人为控制基因表达的方法 通过克隆玉米淀粉分支酶基因 构建高效的siRNA表达体系 将其导入玉米自交系 抑制淀粉分支酶基因的表达 以提高玉米直链淀粉的含量 1 淀粉分支酶基因片段的PCR扩增 引物设计 根据已发表的淀粉分支酶sbe2b基因 G3511235 序列 设计一对引物 5 端引物为5 TTCCCGGGCCATGATGTACACTC 3 3 端引物为5 TCGGATCCCCTGCTAAATCCACC 3 PCR反应体系 在50 L的反应体系中 有dNTP4 0 L 引物各50pmol L 模板0 1 g pCJS2b为模板 EXTaq0 5 L 2 5U 10 Buffer5 0 L MgCl24 0 L 以ddH2O补足到50 L PCR扩增条件为 94 预变性5min 94 变性30s 55 退火30s 72 延伸1min 共30个循环 最后72 延伸10min 得到935bp的目的基因DNA片段 得到935bp的目的基因 淀粉分支酶基因 DNA片段 方法 2 PCR产物的克隆 筛选及序列分析 PCR产物电泳回收后 与pMD18 Tvector以3 1的比例 加ligationsolutionI4 0 L混匀 16 反应过夜 将淀粉分支酶基因与载体连接 再将连接产物转化大肠杆菌DH5 挑取白斑用碱裂解法提取质粒 限制性内切酶酶切鉴定 得到重组质粒 p18 测序 重组质粒包括插入935bp的目的基因 3 siRNA表达体系的建立 将含有分支酶基因片段的重组质粒 p18 和pBI121用SmaI BamHI酶切 连接 得重组质粒pCJSB2b 将pCJSB2b用SmaI SacI酶切 分离大片段 重组质粒 pCJSB2b 用SmaI SacI酶切 分离分支酶基因片段 用T4连接酶连接 得反义 正义片段的表达质粒pCJSBE2b 4 目的基因的转化5 转基因植株的分子检测按35S启动子与终止子序列设计引物 PCR扩增 6 转基因植株的淀粉分支酶活性的检测7 转基因植株淀粉含量的检测 实验结果1 淀粉分支酶基因片段序列 分支酶基因PCR扩增产物在1 0 琼脂糖凝胶上做电泳 得到935bp大小的单一的扩增带 这与预期目的片段 935bp 大小一致扩增产物回收后与pMD18 Tvector载体连接 用连接产物转化大肠杆菌DH5 筛选出9个阳性克隆 经酶切分析 得到一条935bp大小的插入片段 2 外源基因在转基因植株中的整合与表达 用花粉管通道法将pCJSBE2b导入玉米自交系 萌发后以单株植株叶片的总DNA为模板 35S启动子和终止子中的一对序列为引物进行PCR扩增 结果从3株植株中得到2050bp的特异性扩增条带 而未转化的植株中无该片段的产生 外源基因mRNA检测 以转基因玉米籽粒的总RNA为模板 与标记的探针进行Northern杂交 观察到转基因植株内源SBEmRNA的含量明显下降 说明外源siRNA表达结构的导入导致了内源淀粉分支酶mRNA的降解 3 转基因植株的淀粉分支酶活性和淀粉含量 对获