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生产实习报告 15L发酵罐中试实验及酸奶的制备一 实验目的1. 了解15L小型发酵罐及控制器的基本结构2. 掌握小型发酵罐原位灭菌及发酵的操作过程3. 掌握制备酸奶的操作过程二 实验原理（一）15L小型发酵罐用于实验室小型发酵罐的灭菌方法有两种：高压蒸汽灭菌器灭菌和原位灭菌法。灭菌效果的好坏与容器的设计及材料有很大关系，当器皿的工作体积超过15-20L时，由于体积及质量太大就不适合便携了，通常可以采用原位灭菌。本实验采用原位灭菌。1. 发酵罐的结构如果采用常用的水蒸气灭菌，则器皿的材料要能够耐压。湿热灭菌通常在120/103.4kpa的蒸汽压力下进行所以采用的玻璃容器要足够牢固。小型发酵罐及大多数搅拌发酵罐通常可以采用316型不锈钢或相似材料。用玻璃制成的的大型发酵罐如气升式发酵罐或泡罩罐的流量显示装置可以采用在空气压力下水蒸气灭菌几个小时的方法进行。中型搅拌发酵罐的灭菌常用外置夹套和直接向罐中通入饱和蒸汽。有些小型发酵罐常自身附带有蒸汽发生器，另一些可能是在发酵罐和夹套中间有电加热器。体积小于15-20L的搅拌型发酵罐通常是玻璃罐体，不锈钢灌顶和底座的复合结构。有的实验室发酵罐全部采用不锈钢。玻璃罐体和不锈钢灌顶和底座复合结构发酵罐的灭菌最好是在高压蒸汽灭菌器中进行，因此选用合适的高压蒸汽灭菌器很重要。市面上也有可以用原位灭菌的复合结构发酵罐。使用这类型的发酵罐必须配备与之紧密配合的保护套，保护套的设计应考虑足以承受如果灭菌过程中发酵罐爆炸所产生的飞溅的玻璃碎片。原位灭菌的蒸汽可来自蒸汽或由电加热器产生。一般小型不锈钢发酵罐都用蒸汽原位灭菌。玻璃器皿通常放在高，压蒸汽灭菌器里小型发酵罐的辅助容器的灭菌也应该考虑同样的因素，这与复合结构发酵罐，玻璃发酵罐和其它型号发酵罐类似。用热蒸汽灭菌的器皿的体积越大，采用的压力应越小。气升罐和泡罩罐通常高径比较大，因而很难放入高压灭菌器内，此时采用一个大气压力的蒸汽灭菌几个小时也是一个可行的选择。2. 实消或空消搅拌发酵罐一般是装好培养基后进行实罐灭菌。进行实罐灭菌时，培养基的体积只能占发酵罐体积的70%，即要预留3%的空间这是因为要避免培养基沸腾时液体进入空气出口过滤器而导致染菌。采用实罐灭菌比发酵罐空消，培养基分开灭菌机培养基灭菌后再加入发酵罐中操作简单可靠，染菌的概率更小。但并不是任何情况下均可采用实罐灭菌，有时采用发酵罐和培养基分开灭菌更合适。例如，气升式或泡罩式发酵罐使用蒸汽或高压蒸汽灭菌锅灭菌时，由于一个标准大气压的压力下进行培养基灭菌不是很彻底，此时宜将培养基在高压灭菌器中进行单独灭菌后再加入到发酵罐中。也有人认为将搅拌发酵罐空消比装满培养基后进行实消灭菌效果好。尤其是对于原位灭菌的发酵罐，空消得第一次灭菌可以将灭菌时间延长。使用实罐灭菌时，发酵罐和培养基可以选择不同的灭菌方法和不同的灭菌时间，如对热敏感的培养基可以采用过滤法进行除菌。3加热灭菌的操作参数随着温度的提高加热对微生物的破坏速率比对培养基中敏感组分的破坏速率快。所以无论采用哪种加热灭菌方法，最好在最短时间内将发酵罐或容器的温度升至灭菌温度，达到灭菌时间时间后再以最快的速度进行冷却。无论是采用高压蒸汽灭菌器灭菌还是蒸汽原位灭菌都应遵守这个原则。（1）高压蒸汽灭菌器灭菌 高压蒸汽灭菌器的加热方式通常会影响达到灭菌温度的时间，在选择高压蒸汽灭菌器时应注意到这一点。一个普遍的原则是，对于同一加热方式的高压灭菌器而言，高压蒸汽灭菌器的体积越大，其升温降温速度越慢，所需时间越长。灭菌的保持时间应该从容器温度最底部分（装有培养基的容器通常是中部）达到所需要温度开始计时，可以从排气阀门中排除白色蒸汽为准。体积大于1L的容器通常是在120下灭菌15min。更大体积的容器则需要30min或更长时间。应该记住，加热和冷却时容器内温度都将滞后于高压蒸汽灭菌亲内的温度，尤其是对于那些由热传递性能不是很好的玻璃耐高压塑料制成的容器。另外，器皿内液体之间的热传递也很慢，因为不像正常情况下进行搅拌。容器的直径越大，温度滞后效应越明显，所以容器中间的温度与高压蒸汽灭菌器的显示温度有相当大的区别。在同一个高压蒸汽灭菌器中，将10L培养基分别装在玻璃容器和聚丙烯容器中，5L培养基装在玻璃容器中进行对照实验，容器中间部位的温度达到121时分别用了80min，160min，和50min。而空的聚丙烯容器只需20min就可以达到指定温度。有时由于蒸发会造成培养基体积的损失，尽管这个损失很小，但也需要进行测定。（2）蒸汽原位灭菌 发酵罐采用蒸汽原位灭菌时可采用夹套蒸汽加热或电加热器进行加热。这种途径加热阶段的温度-时间图略有不同：夹套蒸汽加热时温度的变化会经过一个对数变化阶段而达到灭菌温度，而电加热则是线性关系。有时，也将蒸汽直接通入发酵罐或容器中来进行灭菌，但这样会造成培养基体积的变化，因为当蒸汽通入时会有水蒸气冷凝，而冷却时又会有蒸汽损失。体积变化是有益还是有害，取决于这些效果的平衡。蒸汽喷射的温度低，则由于冷凝造成的体积越多，尤其在低于100时，一般允许培养基体积增加的范围在5%-10%之间。在配培养基时应该将这个体积变化考虑进行，以防止灭菌后的稀释或浓缩：按照产生体积变化的正负，相应地将灭菌前培养基体积配多或配少。发酵罐原位灭菌通常是在有搅拌的情况下进行，这样可以提高热传递的速度，减少温度梯度，这一点比在高压蒸汽灭菌器中的情况下要好得多。此外，发酵罐或容器的体积越大，则加热和冷却的速率就越慢。4.准备和灭菌选择好灭菌方法后，就可以开始将发酵罐和相关管路准备好进行灭菌。进行灭菌准备时，必须从整个发酵系统来考虑：发酵罐，辅助容器，外围设备及管路。准备工作应该有条理地进行，并且检查两遍，因为任何错误都会造成发酵的损失或需要重复灭菌。首先，用洗涤剂将发酵罐和外围设备彻底清洗。在一些情况下，空罐灭菌被认为是进行最后清洗的理想方式，尤其是对原位灭菌。如果是进行实消，则培养基应该在此时加入。装酸碱消泡剂以及其他添加物的容器如果是同时灭菌也应该在此时接好。否则，任何与发酵罐有关的容器的开口端都要分别包扎进行灭菌。在灭菌时要记住不能将辅助瓶装的太满，装好后，所有的容器都要安全地扎好，以避免泄露。在加热过程中，空气出口管应该打开，这样可以讲容器中的空气排出十分重要，这样可以使所有地方都可以充分地进行湿热灭菌，达到最大的灭菌效果。在进行灭菌时，空气进口的过滤器应该与容器内部分开灭菌，以避免弄湿过滤器，因为这样不仅会使过滤效果变差，冷却时还会在容器内形成真空。所以，如果发酵罐要放入高压蒸汽灭菌器中灭菌，要将出口过滤器的出口塞好盖帽。总之，无论是在高压蒸汽灭菌器内灭菌还是在蒸汽原位灭菌，所有与发酵罐连接的管路都必须是密闭的：系统中的管路如果是在高压蒸汽灭菌器中灭菌，则每个子管都要两端密闭，一端靠近发酵罐，一段靠近辅助器。例外的是用于排气的任何管路都必须开口，如空气出口管。辅助容器都必须有空气出口过滤器，如果这些设备要在高压蒸汽灭菌器中灭菌也要塞好包扎好，不要漏水。电极在放入高压蒸汽灭菌器中前，要用不吸水的棉花塞好并包扎好。溶氧电极灭菌时间应该尽量缩短，而消泡电极在灭菌前应该取出。灭菌的冷却阶段，蒸汽将在器皿内冷凝，如果不采取有效措施发酵罐内会产生真空。真空的产生是极其不利的，不利的影响主要有：会导致容器的破裂，空气从密封不严的地方吸入容器或使空气过滤器染菌或者使热培养基溢出。所以在发酵罐原位灭菌时，通常在温度刚降到100就让无菌空气由进口过滤器进入容器以保证发酵罐内的压力呈现正压，而且可以干燥在冷却时凝结了部分水蒸气的进口和出口的空气过滤器。发酵罐在高压蒸汽灭菌器中冷却时很少去控制它的压力，但是冷却的速率不能太快，以免造成发酵罐内的液体溢出，应尽量避免灭菌器内压力的突然下降，另一方面，也要防止高压蒸汽灭菌器中形成真空。许多高压蒸汽灭菌器中都配有真空释放阀，以便在真空中形成时迅速通入空气。建议在80温度以上时将发酵罐取出，放置在工作台上，打开温度控制系统可使发酵罐迅速冷却，而且可从空气过滤器进口通入无菌空气以保持发酵罐内处于正压状态，同时干燥空气过滤器，这一点与原位灭菌是一致的。（二）酸奶发酵1. 生产酸奶的材料原材料：生产酸奶必须使用无抗生素的新鲜牛奶。理化指标：脂肪3.2%，蛋白质2.8%，干物质10.8%，酸度16-18度，72%酒精试验阴性，活性状态良好，煮沸实验无异常。感官指标：牛乳为乳白色或呈微黄色，不得含有肉眼可见的异物，不得有异常气味。辅料：最常用的甜味剂为白砂糖，添加量不应超过12%。砂糖中的酵母和其他细菌是产品中微生物的来源之一，再将糖添加到产品中去的过程中应有严密的措施来保证成品的细菌指标，保证产品质量。稳定剂：为防止产品出现分层或沉淀现象，保持产品的外观性能而添加到食品中的添加物称为稳定剂。由于稳定剂可以增加食品的粘稠性，固又称为曾调剂。常用的稳定剂有果胶和羧甲基纤维素钠（CMC）。稳定剂添加不当，就难以发挥其作用，最常用的方法是，将稳定剂和干物料（如白砂糖和淀粉）预先用1：5-1：10的比例从干粉状态充分混合均匀，然后再边搅拌边添加到液体物料中溶解。发酵剂：采用冻干菌种，即保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌混合发酵剂，嗜热链球菌产酸，保加利亚乳酸杆菌产酸且产香。嗜热链球杆菌能发酵乳糖生成乳酸，10不能升长，最适合温度在45，能与保加利亚乳杆菌形成很好的共生关系。保加利亚乳杆菌最适合生长温度为40-43，最低生长温度为22，最高生长温度为52.5。2. 发酵原理乳糖在乳酸的作用下转化成乳酸，随着乳酸的形成，溶液的pH值逐渐达到酪蛋白的等电点（pH值为4.6-4.7），使酪蛋白聚集沉降，从而形成半固体状态的凝胶体物质。影响乳酸菌生长增值的因素主要为环境，由于乳酸菌是厌氧菌，因此在混料过程中空气的过多混入或在添加菌种室搅拌时间过长均会影响乳酸菌的正常生长增值，从而影响乳酸成品的质量。3. 搅拌型酸奶的生产工艺鲜奶暂存鲜奶净乳（净乳机）鲜奶冷却鲜奶暂储原辅料混配（高速搅拌缸）料液预热（板式杀菌机）料液均质（高压均质机）巴氏杀菌（管事杀菌机）料液保温杀菌（保温杀菌管）料液冷却（板式热交换器）菌种投入（酸奶发酵罐）保温培养（酸奶发酵罐）发酵终止（酸奶发酵罐）半成品冷却暂存无菌混料（半成品储罐）产品包装（果料）成品冷储（浅冷库房）4. 凝固型酸奶的生产工艺凝固型酸奶生产的前期工艺与搅拌型酸奶相同，在接种菌种并搅拌10分钟后进行灌装。灌装好的半成品在42-43的无菌恒温室静止培养至滴定酸度80度终止发酵，冷却至18-25。三 实验材料15BGZ发酵罐蒸汽发生装置空气压缩机沈阳辉山牛奶沈阳辉山酸奶白糖无水乙醇四 实验步骤（一） 准备1. 按图连接公用管线且必须保证是安全可靠的。2. 连接管盖上的接管（1） 取样阀K8口与过滤器无菌空气出口K6用硅胶联通并放开弹簧夹J2。（2） 过滤器平衡口K5口与排气过滤器回水口K2用硅胶管连接并移去弹簧夹J1，在消毒过程中防止培养基倒流进入进气过滤器。（3） 进气过滤器K7用硅胶管连接并用弹簧夹夹紧。（4） 将pH电极装入N17口，并用螺帽盖紧电极上端口，防止因电缆插口受潮导致电极故障。（5） 将溶氧电极装入N11口并用铝箔纸包裹电极上端口，防止因电缆插口受潮导致电极故障。（6） 盖紧其他灌溉接口。（7） 移去排气冷凝器冷凝水进出口地管。（二） 实罐灭菌1. 启动蒸汽发生器。2. 用保护罩盖住发酵罐并用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4。3. 启动搅拌马达，调转速300r/min。4. 关进水阀W1，开蒸汽冷凝水阀，开蒸汽发生器出口阀，缓缓开蒸汽阀S1，蒸汽进入。5. 升温过程中调整阀V1，节约蒸汽提高效率。6. 当培养基90以上，开蒸汽冷凝水阀V3，微开蒸汽阀S2，蒸汽进入钟罩内，当钟罩顶排气口V4有蒸汽排除时，2分钟后关闭v4并关小V3，当罐温接近120或保温温度时微开阀v4适量排气，并调整蒸汽阀S1维持罐温。7. 保温过程应根据罐温及时调整蒸汽阀s1。保温结束后，关蒸汽阀S2，s1，冷凝阀V1，缓慢开进水阀W1，再将温度控制设定为自动。8. 调整阀v3，排除夹套上法兰沟槽内的水。9. 当温度降至100一下，缓缓开排气阀v4（排气过大易损坏排气过滤器），使保护罩顶部的压力表指示为零（保护罩内无压力），移去保护罩。10. 将进气过滤器K7口与控制箱左侧空气出口连通，开弹簧夹，对发酵罐进行通气，调整空气流量3-5L/min.11. 关阀v3，消毒结束。注意灭菌完毕后，关闭蒸汽发生器并排去蒸汽发生器内残气。当温度达到工艺要求时，调节搅拌转速，空气流量，罐压，标定溶氧电极的斜率及修正pH电极的零点。（三） 发酵操作1. 接种调节进气量至3-5L/min,旋松接种口，在火焰保护下，打开接种口倒入种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。控制器的初始化菜单上按F1设定“发酵批号”并确认，再按F2发酵开始并确认，发酵数据才能自动保存，设定发酵过程参数及适宜的控制模式。取5千克鲜奶煮沸消毒，加白糖300克搅拌，让其自然冷却（冷却中最好能搅拌2-3次，以免乳脂结皮）。冷至40（不烫手）时，在火焰保护下，打开接种口，倒入市面上销售的酸奶（约600克），然后旋紧接种盖，移去火焰圈。42进行发酵培养6-8h。2. 补料操作（1）硅胶管安装：将灭菌消毒的补料瓶及输液管放置于搁架上，开蠕动泵透明的防护盖，掰开蠕动泵进出口处的白色管夹，将硅胶管（进料瓶端）嵌入入口处的管夹，并使之夹紧，用手转动蠕动泵泵头，同时将硅胶管沿蠕动泵凹槽安装直至蠕动泵出口处，然后开蠕动泵手动开关约10秒钟左右，再夹紧蠕动泵出口处管夹，关闭手动开关。（2）将酒精棉球放在罐盖补料口内，然后将针头插入并穿透密封盖。（3）打开蠕动泵手动开关，使输液管中充满料液。置蠕动泵开关于自动状态。（4）酸碱液，消泡剂操作同补料操作。 3. 取样 （1）松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管内残液混入发酵罐内。 （2）夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开口，发酵液被压入接料瓶（也可以通入减少排气，增加罐压来加快取样速度）。 （3）开j2 J3排出取样管内残料。 （4）取样完毕后将J3 j2夹紧。 （5）发酵开始进行时开始，每隔一个小时进行一次取样操作直到发酵结束为止。将取完后的样品放置于冰箱中冷藏。 （6）所有样品取完后，分别测定每个时刻的样品pH值。 4. 放料 同取样操作。 每次发酵结束，必须在控制器初始化菜单中确认“发酵结束”，关闭空气压缩机。 将发酵液置于冰箱或冰水中数小时，待冷却老熟后即成酸奶。（四） 实验仪器本实验所用的发酵罐以及蒸汽发生器如下图所示：上图为KQ-C型全自动蒸汽发生器，该仪器是全自动形式，操作过程中只需打开电源即可自行工作。其中的黄色的注水按钮正常状态下为不亮的，当蒸汽用完时自动启动向其中注水。而红色加热按钮为始终亮着的用于加热。该蒸汽发生器的作用就是为发酵罐提供灭菌空气，将水加热成高温蒸汽，通过管道输入发酵罐中用于发酵罐的灭菌。蒸汽发生器后面有上下两个扳手开关，当刚开始加热时两个上面扳手是打开状态与大气相通，下面为关闭状态与发酵罐相通。目的是为了保证仪器内压力平衡。当加热完成后水变成高温蒸汽时，将上面扳手关闭，打开下面扳手将蒸汽通入到发酵罐内进行实罐灭菌。注意：(1)其中仪器上的压力表显示的是表压，仪器内的实际压力应用表压加上大气压。(2)在使用仪器时，特别是扳动开关时一定要注意安全，因为从仪器出来的为高温高压的水蒸气，一旦被蒸汽喷到后果很严重。因此，在操作时最好带上手套。上图所示为本次实验所用到的15L小型发酵罐右侧的仪器是用于时时检测发酵罐中的各种实验数据，如温度，pH值，溶氧系数等。仪器上的显示屏就相当于一个小型的电脑用于控制。同时当发酵罐中料液减少时，它能向发酵罐中补充培养液，还能将水蒸气加热通入发酵罐中。注意：由于本实验中乳酸发酵是一个厌氧发酵，因此，不需要向发酵罐中通入氧气。同时对发酵液的pH值要求不高，也不需要调节发酵罐中的pH值。本次发酵罐中的培养基足够一次酸奶发酵所需，因此不需向其中补料。（五）实验结果1. 整理发酵过程中所测定的各种数据资料。 图（一） 图（二）在以上两个图片中，图（一）显示的是乳酸发酵过程中的参数以及发酵罐中的压力变化。从图中可以看出，发酵过程中的温度为59.3，而要求的发酵温度为42。主要是因为对发酵罐进行实罐灭菌之后，内部的温度很高要想将温度降下来需要很长一段时间。本实验中对发酵条件的要求不是很高，因此可能会影响菌种的生长，但是影响不大。发酵罐的罐压是随着发酵的进行而逐渐增大的，目的是要维持罐内的压力呈正压防止外界空气进入罐内，使发酵罐染菌。但是罐压要维持在一定压力范围内，不能超过1.5Mpa。若超过这个值发酵罐内压力太大可能造成危险。如图（二）所示，左侧的仪表显示的是钟罩内的罐压，要维持其所指示的数值不超过1.5，若超过1.5时可通过调节右侧的安全阀使其向外排气来维持罐压。安全阀除了可以维持罐内压力不超过一定值外，还有当罐内呈负压时，安全阀会自动跳开使空气进入维持罐内外压力平衡。本次实验为半自动操作，只有温度和转数可以自动测定，而pH，罐压，溶氧等我们都是手动测量的。2. 比较市售酸奶和发酵所得酸奶的外观形态及口味。（1）发酵结束后观察酸奶的外观形态如下图所示：刚发酵完的酸奶上面漂着一层泡沫状白色固体物质，该物质应该为酸奶在发酵过程中产生的酪蛋白，酪蛋白又称干酪素，酪素。通常是指由牛乳腺分泌的多种磷蛋白的混合物。存在于牛奶或干酪中，在鲜牛奶中含量约3，是牛乳蛋白重要组分，占总蛋白80以上。因此，它是在牛奶发酵过程中产生的。发酵结束后刚打开发酵罐一股浓浓的酸奶香味扑鼻而来，由于发酵罐在清洗时没有进行消毒而且清洗不是特别干净，因此我们没有品尝它的味道，但那浓浓的酸奶香气其中还混杂着纯纯的牛奶香气，早已让我们陶醉了。外观形态上与市售酸奶比较它没有市售酸奶那样粘稠，有些市售酸奶近乎呈块状很稠，而我们发酵的酸奶还是呈液体状，但是比刚开始发酵的牛奶要粘稠多了。分析原因可能是因为市售酸奶在生产过程中加入了粘稠剂，以及其他一些食品添加剂等。因此会让酸奶的形态改变同时口感也会改变。我们得酸奶是没有加入任何添加剂的，口感应该特别纯正。（2）测定每个时刻酸奶发酵样品的pH值测得样品的pH值与标准比色卡对照如下