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质谱分析法 MassSpectrometry 概论 质谱仪及其工作原理 离子和碎裂类型 分子式的测定 一 概论 概念 有机化合物在高真空中受热气化以后 经电子流冲击 就会产生各种阳离子 在电场和磁场的综合作用下 按照核质比的大小分开 排列成谱 即为质谱 应用质谱研究有机化合物的结构 是一个很重要的课题 但必须结合紫外光谱 红外光谱 核磁共振谱等物理仪器及化学反应结果进行综合判断 才能得到正确结论 纵坐标表示离子的强度 一般用相对丰度表示 即以最强峰 基峰 为100 其他的峰则以此为标准 确定其相对强度 横坐标是质核比 特点 信息量大 应用范围广 是研究有机化合物结构的有力工具 由于分子离子峰可以提供样品分子的相对分子量的信息 所以质谱法也是测定分子量的常用方法 分析速度快 灵敏度高 高分辨率的质谱仪可以提供分子或离子的精密测定 质谱仪器较为精密 价格较贵 工作环境要求较高 给普及带来一定的限制 应用 质谱法测定的对象包括同位素 无机物 有机化合物 生物大分子以及聚合物 广泛应用于化学 生物化学 生物医学 医药学 生命科学以及工 农 林业 地质 石油 环保 公安国防等领域 二 质谱仪及其工作原理 质谱仪需要在高真空下工作 离子源 10 3 10 5Pa 质量分析器 10 6Pa 高真空系统 质谱仪的进样系统 离子源 质量分析器 检测器等主要部件均须在真空状态下工作 一般为10 4 10 6Pa 避免离子散射以及离子与残余气体分子碰撞引起的能量变化 同时也可降低本底和记忆效应 高真空系统一般是由旋转泵和扩散泵串连组合而成 亦可采用分子泵以获得更高的真空度 样品的导入与离子源 1 样品导入系统 直接进样 适合于单组分 挥发性较低的固体或液体样品 用直接进样杆尖端装上少许样品 几纳克 经减压后送入离子源 快速加热使之气化并被离子源离子化 色谱联用导入进样 利用与质谱仪联机的气相色谱仪或高效液相色谱仪将混合物分离后 通过特殊的联机 接口 进入离子源 以此进行各组分的质谱分析 仪器内部结构 2 离子源 离子源式质谱仪器最主要的组成部件之一 其作用是使被分析的物质电离成为离子 并将离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束 常用于有机物电离的离子源是电子轰击源 为了得到丰度较高的分子离子峰或准分子离子峰 可采用较温和的化学电离或场解吸离子源 对于一些难挥发 强极性 分子量大的物质或生物大分子 可采用快速原子轰击 激光电离 电喷雾等电离源 产生的离子流稳定性高 强度能满足测量精度 离子束的能量和方向分散小 记忆效应小 质量歧视效应小 样品和离子的利用率高 在灯丝 阴极 与阳极间加电压后 炽热的灯丝 铼或钨丝 发射的电子束穿过电离盒至阳极 两极间的电位差决定了电子的能量 进入EI离子源的试样蒸气被电子束轰击 当轰击电子的能量大于分子的电离能 分子M将失去电子而发生电离 通常失去一个电子而形成分子离子M 电子轰击源 electronimpactsource EI 电子轰击离子源一般由电离盒 灯丝 或称阴极 栅极 电子收集极 狭缝 永久磁铁 电离盒加热器 热电偶以及一套离子光学系统 或称透镜系统 包括推斥极 引出极 聚焦极 Z向偏转极等 组成 优点 重现性好 灵敏度高 碎片离子丰富信息 离子开裂理论成熟 应用最广 标准质谱图基本都是采用EI源得到的 稳定 操作方便 电子流强度可精密控制 结构简单 控温方便 缺点 EI离子化能量高 对分子量较大或者稳定性差的试样 常常得不到分子离子峰 化学电离源 chemicalionizationsource CI 利用低压样品气 10 5 和高压的反应气 1 2 甲烷 异丁烷 氨 氢 氦等 在高能电子流 500eV 轰击下 发生离子 分子反应来完成样品离子化 优点 软电离方式 准分子离子峰强度大 易获得有关化合物官能团的信息 缺点 重现性较差 不适合于难挥发 热不稳定的化合物 场致电离源 FI 优点 分子离子峰强 碎片离子峰少 适用于较大分子量和热不稳定化合物电离缺点 不适合化合物结构鉴定 是采用强电场把冷电极附近的样品分子的电子拉出去 形成离子 电场的两电极距离很近 d 1mm 施加电压为几千伏甚至上万伏稳定直流电压 场电离 将气体通过电场电离 场解析 将固体样品涂在发射体表面使之电离 快原子轰击离子源 fastatombombardmentionizationsource FAB 由电场使Xe原子电离并加速 产生快速离子 通过快原子枪产生电荷交换得快速原子 快原子束轰击涂在金属板上的样品 使样品离子化 优点 无需进行加热气化 属于软电离方式 特别适合分析高极性 大相对分子量 难挥发和热稳定性差的样品 既能得到强的分子离子或准分子离子峰 也能得到较多的碎片离子峰 缺点 重现性较差 检测灵敏度低 电喷雾电离接口 ESI 大气压化学电离接口 APCI 1 液相入口 2 雾化喷口 3 APCI蒸发器 4 电晕放电针 5 毛细管 6 CID区 7 锥形分离器 8 八级杆 9 四级杆 10 检测器 4 质量分析器 质量分析器是指质谱仪中将不同质荷比的离子分离的装置 目前用于有机质谱仪的质量分析器主要是磁偏转式 四极杆式和离子阱 1 磁偏转式质量分析器 加速后离子的动能 1 2 m 2 eV 在磁场存在下 离心力 向心力 即m 2 R H0eV曲率半径 R m eH0 所以 质谱方程式 m e H02R2 2V 离子在磁场中的轨道半径R取决于 m e H0 V 改变加速电压V 可以使不同m e的离子进入检测器 单聚焦磁场分析器 方向聚焦 相同质荷比 入射方向不同的离子的汇聚但m z相同 运动速度v有微小差异的离子在通过磁场后会发散 导致仪器的分辨率降低 双聚焦磁场分析器 能量聚焦 相同质荷比 速度 能量 不同的离子的会聚 质量相同 能量不同的离子通过电场和磁场时 均产生能量色散 两种作用大小相等 方向相反时互补实现双聚焦 大大提高了分辨率 四极杆质量分析器 四级滤质器 由四根平行且对称放置的圆柱形电极组成 对角电极连接构成两组 两组电极间加以一定的直流电压U和高频电压Vcoswt 当离子束进入圆柱形电极所包围的空间后 将受到交 直流叠加电场的作用而波动前进 只有某一种或一定范围质荷比的离子能够通过电场区到达收集器产生信号 优点 可在较低的真空度下工作 扫描速度快 结构简单 体积小缺点 分辨率低于双聚焦质量分析器 质量范围较窄 不能提供亚稳离子信息 离子阱质量分析器 飞行时间质量分析器 5 离子监测器 现代质谱仪的离子检测器常采用电子倍增器及微通道板检测器 一般电子倍增器的增益可达106 放大后的信号进入宽频放大器被再次放大 即可将微弱的离子信号转变为较强的电信号送入记录及数据处理系统 6 质谱图 LC MS分析条件的选择 1 电离源的选择ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子 特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子 蛋白质 只要有相对强的极性 ESI对小分子的分析常常可以得到满意的结果 APCI不适合多电荷的大分子分析 它的优势在于非极性或中等极性的小分子的分析 电离方式ESI采用离子蒸发方式使样品分子电离 而APCI电离是放电探针促使溶剂和其它反应物电离 碰撞及电荷转移等方式形成了反应气等离子区 样品分子通过等离子区时 发生了质子转移 样品流速APCI源允许的流量相对较大 0 2 2mL min 而ESI源允许流量相对较小 最大只能为1 0mL min 断裂程度APCI源的探头处于高温 可使热不稳定的化合物分解 产生碎片 ESI源探头处于常温 常生成分子离子峰 不易产生碎片 灵敏度都很高 ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物 而APCI更适合于分析极性小的化合物 多电荷APCI源不能生成一系列多电荷离子 所以不适合分析生物大分子 而ESI源特别适合于蛋白质 多肽类的生物分子 由于它能产生一系列的多电荷离子 2 正负离子模式的选择 正离子模式适合于碱性样品 可用乙酸 pH 3 4 或甲酸 pH 2 3 对样品加以酸化 负离子模式适合于酸性样品 可用氨水或三乙胺对样品进行碱化 有些酸碱性并不明确的化合物 可优先选用APCI 进行测定 3 流动相的选择 1 水 乙腈及甲醇是LC MS理想的溶剂2 乙酸和甲酸可降低LC流动相的pH值以提高分离度3 氢氧化铵 氨溶液可提高LC流动相的pH值4 乙酸铵是一种挥发性盐 用于缓冲流动相 并改善色谱分离而不影响MS的性能 最大浓度不超过0 1mol L 常用的溶剂和缓冲液 不适合的溶剂和缓冲液 1 不挥发的盐2 表面活性剂 洗涤剂3 无机酸 1 异丙醇 2 甲氧基乙醇及乙醇等2 三氟醋酸 TFA 常用于LC MS分析肽和蛋白质的化合物3 三乙胺 TEA 4 四氢呋喃 THF 其它溶剂和调节剂 三 离子和碎裂类型 1 离子类型 分子离子 molecularion 分子在离子源中失去一个电子形成的离子 分子离子的质量与化合物的分子量相等 一般出现在质谱的最右侧 有机化合物分子离子峰的稳定性 芳香化合物 共轭链烯 烯烃 脂环化合物 直链烷烃 酮 胺 酯 醚 酸 支链烷烃 醇 m z 碎片离子 fragmention 分子在电离源中获得的能量超过分子离子化所需的能量时 分子中的某化学键断裂而产生的碎片离子 正己烷的碎片 同位素离子 isotopicion 大多数元素都是由具有一定自由丰度的同位素组成的 由于同位素的存在 可以看到比分子离子峰大一个质量单位的峰 有时还可以观察到M 2 M 3 称为同位素离子峰 例如 CH4M 1612C 1H 4 16M13C 1H 4 17M 112C 2H 1H 3 17M 113C 2H 1H 3 18M 2 同位素峰 分子离子峰 1 15 16 m z RA 3 1 12 13 14 15 16 17 1 0 3 9 9 2 85 100 1 1 亚稳离子 metastableion 离子脱离离子源后并在磁场分离前 在飞行过程中发生裂解而形成的低质量离子 这种离子的能量比在离子源中产生的离子的能量小 且很不稳定 在质谱中称亚稳离子 准分子离子 quasi molecularion 只与分子存在简单关系的离子 通常它也可以确定分子量 例如分子得到或失去一个氢生成的 M H 或 M H 就是最常见的准分子离子 多电荷离子 multiply chargedions 带有两个甚至两个以上电荷的离子 它们时常具有非整数质荷比 因而出现在质谱图的分数质量上 最常见的是双电荷离子 奇电子离子与偶电子离子 电子总数为奇数的离子称奇电子离子 用 表示 较易碎裂 电子总数为偶数的离子称偶电子离子 奇电子离子含有一个未成对电子 偶电子离子不含未成对电子 奇电子离子碎裂可产生奇电子离子或偶电子碎片离子 偶电子离子碎裂产生偶电子碎片离子是有利的 而产生奇电子碎片离子是不利的 但也有例外 EI质谱中主要产生单电荷离子 氮规则 不含氮的有机物 其分子量为偶数 奇电子离子的质荷比为奇数 偶电子离子的质荷比为偶数 含有奇数氮的有机物 其分子量为奇数 含偶数氮的有机物 其分子量为偶数 含有奇数氮的奇电子离子质荷比为奇数 含偶数氮的奇电子离子质荷比为偶数 含奇数氮的偶电子离子质荷比为偶数 含偶数氮的偶电子离子质荷比为奇数 在有机化合物分子中 若含有偶数 包括零 个氮原子的 则其分子量为偶数 若含有奇数个氮原子的 则其分子量为奇数 半异裂 异裂 均裂 及表示法 在离子断裂过程中 如果自由基离子的一个孤电子转移到一个碎片上 这种断裂叫 半异裂 用一个鱼钩状的半箭号表示孤电子转移的途径 如果一个键断开时的一对电子同时转移到同一个碎片上 这种断裂叫 异裂 用一个完整的箭号表示一对电子的转移 如果一个键断开时的一对电子分别转移到所断裂的两个碎片上 这种断裂叫 均裂 用两条不同方向的鱼钩状半箭号表示两个电子的不同转移方向 2 有机分子裂解类型 1 断裂 分子中 键在电子轰击下失去一个电子 随后分子裂开生成碎片离子和游离基的裂解方式 为简单的键断裂 多发生于烷烃 若分子中含有杂原子或 键 对于饱和烃 取代度愈高的碳 其 键越容易被电离 且取代度越高的碳正离子越稳定 2 断裂 游离基中心诱导的键断裂 烯烃 电离时失去一个 电子 则 键上的自由基中心引发 断裂 如果是端烯则发生烯丙基断裂 形成稳定的典型烯丙基离子 41 烷基苯的苄基断裂 所产生的苄基离子立即重排为典型的鎓离子C7H7 而且进一步丢失C2H2而产生C5H5 含饱和官能团的化合物 如胺 醇 醚 硫醇 硫醚 卤代物等 电离后构成杂原子上的自由基中心 引发了 断裂 胺 醇 醚 卤化物 含不饱和官能团的化合物 如酮 酸 酯 酰胺 醛等也发生 断裂 2 诱导断裂 也称i断裂 在奇电子 OE 或偶电子 EE 离子中 由于正电荷的诱导效应 吸引了邻键上的一对成键电子而导致该键的断裂 称为诱导断裂 此时 断裂键的一对电子同时转移到一个碎片上 因此属于 异裂 含有杂原子的化合物 如醇 醚 酮 酸 卤代物等均可发生i断裂 如酮的i断裂 诱导断裂的能力随杂原子电负性的增强而增强 X O S N C X为Cl Br I 一些饱和烃的偶电子离子 也发生i断裂 脱去一个烯 3 重排开裂 断裂两个或两个以上化学键 重新排列形成 产生重排开裂的主要原因 重排离子具有更高的稳定性 能够脱去稳定的中性分子 需要裂解的临界能较低 开裂中心在易于移动的氢附近 重排开裂有两种常见的方式 McLafferty重排 麦氏重排 和逆Diels Alder重排 RDA重排 麦氏重排 当化合物中含有不饱和C X基团 X为O N S C 且与该基团相连的键上具有 氢原子时 氢原子可重排 转移 到不饱和基团上 通过六元环过渡态 同时 键断裂 脱去一个中性分子 麦氏重排前后 重排离子的电子的奇偶性不变 重排裂解时若失去奇数个氮原子 则质量奇偶性发生变化 否则质量数的奇偶性也保持不变 这种重排方式规律性强 在质谱解析中应用广泛 逆Diels Alder重排 环己烯衍生物的开环反应是由 电子提供的游离基反应中心引发 通过两次 开裂 形成一个中性分子和一个离子化的丁二烯衍生物 丁二烯离子 中性分子 在酯环化合物 生物碱 萜类 甾体及黄酮等物质的质谱图上 经常可发现由RDA重排产生的碎片离子峰 四 分子式的测定 1 分子离子峰的确定 一般说来 质谱图上最右侧出现的质谱峰为分子离子峰 同位素峰虽然比分子离子峰的质荷比大 但由于同位素峰与分子离子峰的峰强比有一定的关系 因而不难辨认 但是 有些化合物的分子离子极其不稳定 其质谱最右侧的质谱峰不一定是分子离子峰 因而在识别分子离子峰时 还需要掌握以下几点 分子离子含奇数个电子 OE 含偶数个电子的离子 EE 必定不是分子离子 分子离子稳定性排序 芳香化合物 共轭链烯 烯烃 脂环化合物 直链烷烃 酮 胺 酯 醚 酸 支链烷烃 醇 分子离子的质量数服从氮律 由C H O组成的有机化合物 分子量一定是偶数 由C H O N组成的有机化合物 N个数为奇数 则分子量为奇数 N个数为偶数 则分子量为偶数 分子离子峰与相邻峰的质量差必须合理 如果相邻峰与该峰相差3 14个质量数 则该峰不是分子离子峰 M 1峰的出现 有些化合物的质谱图上质荷比最大的峰是M 1峰 而无分子离子峰 2 分子量的测定一般来说 分子离子峰的质荷比等于分子量 MW 但是严格来说有所差别 因为质荷比是由丰度最大的同位素的质量计算 而分子量是由原子量计算而得 而原子量是由同位素质量的加权平均值 3 分子式的确定质谱的一个很大用途是确定化合物的分子量 并且由此而得到分子式 对于低分辨质谱来说常用同位素