1.2DNA重组技术的基本操作程序.doc

12 基因工程的基本操作程序【学习目标】1简述基因工程原理及基本操作程序。2尝试设计某一转基因生物的研制过程。【教学重点】基因工程基本操作程序的四个步骤。【教学难点】1从基因文库中获取目的基因。2利用PCR技术扩增目的基因。【预习导学】一、目的基因的获取：1目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的。2获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物不同基因的许多，导人受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库：含有一种生物的 基因种类cDNA文库：含有一种生物的基因目的基因的获取根据基因的有关信息：基因的序列、基因在上的位置、基因的产物mRNA、基因的产物蛋白质等特性获取目的基因。(2)利用PCR技术扩增目的基因PCR：是一项在生物体外特定DNA片段的核酸合成技术。条件：已知目的基因的序列。过程：目的基因DNA受热形成，与结合，然后在_的作用下进行延伸形成DNA。方式：指数扩增=2n(n为扩增循环的次数)(3)人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。【例题巩固】( )例1下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B C D( )例2（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。 图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。第1组： ； 第2组： 。(3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。(4)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb 即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。二、基因表达载体的构建1表达载体的组成：目的基因+标记基因等。2启动子：位于基因的，它是和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。3终止子：位于基因的，终止。4标记基因：受体细胞是否含有目的基因。5表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且给下一代；同时使目的基因_和发挥作用。6不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。( )例3科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。由以上过程推知，作为目的基因的运载体应具备的结构是 A目的基因、启动子 B目的基因、终止子 C目的基因、启动子、终止子 D目的基因、启动子、终止子、标记基因三、将目的基因导入受体细胞(一)转化：目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和的过程。(二)方法1将目的基因导入植物细胞(1)农杆菌转化法农杆菌特点：易感染植物和裸子植物，对_植物没有感染力；Ti质粒的可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。转化：目的基因插人农杆菌导入植物细胞目的基因整合到植物细胞染色体上目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。(2)基因枪法 基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。(3)花粉管通道法 花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。（我的的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）2将目的基因导入动物细胞(1)方法：注射技术。(2)操作程序：目的基因表达载体取卵(受精卵) 显微注射注射了目的基因的受精卵移植到_性动物的_内发育新性状动物。3将目的基因导人微生物细胞(1)原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。(2)大肠杆菌最常用的转化方法是：处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。( )例4采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵 A、 B、 C、 D、四、目的基因的检测与鉴定1检测 (1)方法：DNA分子杂交技术、抗原抗体分子杂交方法。 (2)内容 检测转基因生物染色体的DNA是否插入。 检测目的基因是否转录。 检测目的基因是否翻译成。2鉴定：鉴定、抗病鉴定等。巩固练习：一、选择题：1下列属于获取目的基因的方法的是利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术 利用DNA转录人工合成A B CD2不属于目的基因与运载体结合过程的是A用一定的限制酶切割质粒，露出黏性末端B用同种限制酶切割目的基因，露出黏性末端C将切下的目的基因插入到质粒的切口处D将重组DNA引入到受体细胞中进行扩增3有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成在细胞内完成C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料4哪项不是基因表达载体的组成部分A启动子 B终止密码 C标记基因 D目的基因5在胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的同一种限制酶切割两者；不需同一种限制酶切割两者；加入适量的DNA连接酶；不需加DNA连接酶A B C D6下列说法中正确的是A基因表达载体的构建方法是一致的 B标记基因也叫做抗生素基因C显微注射技术是最为有效的一种将目的基因导入植物细胞的方法D大肠杆菌是常用的微生物受体7基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞。下列不属于这样做的原因的是A结构简单，多为单细胞B繁殖速度快C遗传物质含量少D性状稳定，变异少8要检测目的基因是否成功的插入了受体DNA中，需要用基因探针，基因探针是指A用于检测疾病的医疗器械 B用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子C合成一球蛋白的DNA D合成苯丙羟化酶的DNA片段9基因工程的正确操作步骤是构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞检测目的基因的表达是否符合特定性状要求获取目的基因A B C D10下列有关基因工程技术的叙述，正确的是A重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和基因进入受体细胞的载体B所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C选用细菌作为重组质粒的受体细胞主要是因为细菌繁殖快、遗传物质少D只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达11基因工程中不会出现ADNA连接酶将黏性末端的碱基连接起来B限制性内切酶可用于目的基因的获取C目的基因必须有载体导入受体细胞 D人工合成目的基因不用限制性核酸内切酶（11年四川卷）12.北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强，下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是A过程获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序B多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白，C过程构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达多选13下列有关基因工程的说法中正确的有A一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列BDNA聚合酶可以用来“缝合”目的基因与运载体之间的缺口C“不同的DNA分子具有相同的双螺旋结构”是基因工程成功实施的基础D黏性末端碱基对之间的连接需要DNA连接酶的催化多选14下列有关DNA聚合酶链式反应(PCR)的说法正确的是A需要引物B始终在高于70的条件下进行C需要加DNA连接酶D不需要加限制性内切酶二填空题：15根据下列所给材料回答问题：材料一把人的胰岛素基因拼接到大肠杆菌的质粒上，然后导入大肠杆菌内，产生出人的胰岛素。材料二把萤火虫的荧光基因转入烟草体内，培育荧光的烟草。材料三有人把蜘蛛产生丝腺蛋白的基因转入羊的细胞中，在羊分泌的乳汁中加入某种物质后，可抽出细丝，这种细丝可望用作手术的缝合线。(1)上述生物新品种的产生运用了技术。(2)一种生物的基因在另一种生物体内能够表达，而不影响其他基因的表达，这说明基因是有_效应的片段，具有一定的性；同时可以说明各种生物共用一套。(3)上述技术所用的工具酶有。(4)可遗传的变异分为三种：、，而基因工程改变一个物种的基因属于。(5)从上述所给的材料，不能得出哪一结论 A动植物之间可以相互转基因B真核生物与原核生物之间可以相互转基因C基因工程可以定向地改变生物的基因D转基因生物的出现对生物的进化是有利的16右图是将人的生长激素基因导人细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导人细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题：(1)目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。以下步骤可鉴别得到的细菌是否导人了质粒A或重组质粒：将得到的细菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就导人了质粒A或重组质粒，反之则没有。使用这种方法鉴别的原因_ _。 (2)若把通过鉴定证明导人了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，会发生的现象是_。原因是：_。(3)导人细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么?_。(09年江苏高考)17苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。(1)将图中的DNA用HindIII、BamH I完全酶切后，反应管中有_种DNA片段。 (2)图中表示HindIII与Bam I酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_种重组质粒；如果换用Bst l与BamH l酶切，目的基因与质粒连接后可获得_种重组质粒。 (3)目的基因插人质粒后，不能影响质粒的_ 。 (4)图中的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的TDNA导人植物细胞，并防止植物细胞中_对TDNA的降解。 (5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞_ 。 (6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的_基因频率的增长速率。33（8分）(1)15/16 三 (2)引物I和引物局部发生碱基互补配对而失效 引物I自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3) DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结 合到双链DNA片段的引物链上(4)见右图D D D B A D D B C C A B AC AD基因工程 遗传 DNA 独立 密码子 限制酶 DNA连接酶 基因重组 基因突变 染色体变异 基因重组 D答案：(1) 普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因(2)有的能生长，有的不能生长期 导入普通质粒A的的细菌能生长，因为普通质粒A上有抗四环素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在四环素