免疫组化及PCR操作流程.doc

细胞免疫组化步骤1.PBS冲洗两次2.丙酮固定10min3.浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37 30 min4.PBS振洗2次,每次3min5.加封闭血清,湿盒内37 30 min6.弃去血清7.加一抗, 37 3060min (1:200 1:150稀释)8.PBS振洗3次,每次3min9.加二抗, 37 30 min10.PBS振洗3次,每次3min11.加ABC复合剂, 37 30 min12.PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min13.浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处1020min14.自来水洗5min15.染核 浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精，自来水洗，过氨水，自来水洗16.逐级脱水，701次，952次，无水3次 每次1min17.透明，过二甲苯3次，每次1min18.封片 将有细胞的一面向下封片一、 免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。8）TBS/PBS pH9.09.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95左右，放入组织芯片加热1015分钟。（3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔510分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax， Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras， Rb，Topoismerase等。2）酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37，切片也预热至37，消化时间约为530分钟；胃蛋白酶消化37时间为30 分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。3、免疫组织化学染色SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗23次各5分钟； 5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加抗50l，室温静置1小时或者4过夜或者371小时。9）4过夜后需在37复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加抗4050l，室温静置，或371小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC法1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4)抗原修复。5)PBS洗5分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加抗,室温1小时或者4过夜或者371小时（4过夜后在37复温45分钟）。8)PBS洗三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗,203720分钟。10)PBC洗3次每次2分钟。11)滴加试剂SABC，203720分钟。12)PBS洗4次每次5分钟。13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15)脱水、透明、封片、镜检。二、 原位杂交操作规程（一）、仪器设备 医用微波炉； 水浴锅。（二）、试剂 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用前加）2.5ml。20SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，H20 定容1L。100Denhardts：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。杂交液：Formamide 5ml，20SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100Denhardts 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。Buffer（pH7.5）：0.1mol/L TrisCl，0.15mol/L NaCl。Buffer（pH9.5）：0.1mol/L TrisCl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。Buffer（pH8.0）：10mmol/L TrisCl，1mmol/L EDTA。（三）、操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1） 二甲苯于37脱蜡2次，每次15分钟；2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4） PBS清洗3分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗10分钟；7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37孵育15分钟；8） PBS清洗2次，每次3分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2SSC清洗10分钟；21）37，1SSC清洗10分钟；22）37，0.5SSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟；24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37孵育3 小时；26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1） 二甲苯于37脱蜡2次，每次15分钟；2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4） PBS清洗5分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗5分钟；7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37孵育10分钟；8） PBS清洗2次，每次5分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2SSC清洗10分钟；18）37，1SSC清洗10分钟；19）37，0.5SSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。三、 原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程（一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。（二）、操作流程1、原位PCR步骤1）预处理：（1）切片常规脱蜡；（2）0.2mol/L HCl处理10min；（3）5g/ml蛋白酶K消化组织3710min；（4）Nase消化组织37 30min；（5）梯度酒精脱水，室温干燥。2）原位扩增：（1）切片滴加特异性序列引物30LPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；（2）PCR热循环：94，1min；55，1min；72，1.5min，共2530个循环，72延伸10min；（3）氯仿洗去盖玻片，4多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。3) 原位杂交：（1）加地高辛标记探针的杂交液，98变性10min，-20退火5min，42杂交过夜。（2）杂交后用2SSC洗涤10min，3次，1SSC洗涤10min，3次；（3）缓冲液洗涤10min，3次；（4）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37，2h；（5）缓冲液洗涤5min，3次；（6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。（7）常规脱水：透明、封固。2、原位RT-PCR步骤1）预处理：（1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54消化20min，蒸馏水洗；（2）95加热3min，灭活残存的蛋白酶。2）原位扩增：（1）在有RNA酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；（2）用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95，2min。再将热循环仪设定为95，45s，55，1min和75，45s，共26次循环；（3）扩增结束后，在80烤15min30min。3）原位杂交：（1）杂交前标本95加热3min；（2）加上杂交液，湿盒内50过夜；杂交液组成：25硫酸葡聚糖，2SSC，50甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA， 每05mL杂交液内含生物素标记探针1ng。（3）扩增的-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。3、荧光原位杂交（FISH）和用引物介导的原位标记（PRINS）操作规程仪器设备1、 医用微波炉；2、 水浴锅；3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。FISH试剂（1）1PBS：由10PBS溶液稀释而成，储存于4；（2）20SSC（pH7.0）；（3）2SSC，由20SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。（5）变性液(70甲酰胺+2SSC，pH7.0)：4ml 20SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。（6）杂交后洗涤液：20SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。2） 37水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37孵育20min。3） SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。4）梯度酒精脱水（-20预冷）。3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78孵育8min；4） 即移入-20预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10l探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37孵育12h16h。杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2SSC(37)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1PBS内待检测，勿使切片干燥。检测：9）从1PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。10）每张切片使用30l60l罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1PBS的染色缸。1PBS室温下洗3次，每次2min。扩增：12）从1PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30l60l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1PBS的染色缸。1PBS室温下洗3次，每次2min；15）从1PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30l60l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1PBS室温下洗3次，每次2min。5、细胞核染色：1）张切片加10l20l DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育25ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。PRINS步骤1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；2、用0.2mol/L盐酸处理5min；3、蛋白酶K(25g/m1)消化37 15min；4、分别用80，95和100酒精脱水，室温干片；5、加PCR混合液25L(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200mol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5l，引物250ng，