纤维素和木质素合成酶基因的研究.doc

纤维素和木质素合成酶基因的研究摘要： 纤维素（cellulose）是由葡萄糖组成的大分子多糖。不溶于水及一般有机溶剂。是植物细胞璧的主要成分。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。棉花的纤维素含量接近100%，为天然的最纯纤维素来源。一般木材中，纤维素占4050%，还有1030%的半纤维素和2030%的木质素。从1 9 9 6年第一个植物纤维素合酶基因的鉴定，人们对植物体内纤维素合成的研究已经走过了1 0年的历程。10多年中，人们取得了很大的成果。木质素也是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。木质素是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。化石能源的日益枯竭、木质素的丰富储量、木质素科学的飞速发展决定木质素的经济效益的可持续发展性。木质素成本较低，木质素及其衍生物具有多种功能性，可作为分散剂、吸附剂/解吸剂、石油回收助剂、沥青乳化剂。纤维素和木质素对人类可持续发展最为重大贡献就在于提供稳定、持续的有机物质来源，所以其应用前景十分广阔。本文主要对植物中纤维素和木质素合成酶基因的研究进行论述。关键词： 纤维素 木质素 调控 基因 合成 植物Study of Cellulose and lignin synthase geneAtract：Cellulose (cellulose) is composed of glucose molecules by the polysaccharide. Insoluble in water and common organic solvents. Bi is the main component of plant cells. Cellulose is the most widely distributed in nature, the most abundant of a polysaccharide, accounting for the vegetable kingdom for more than 50% of carbon content. Cotton cellulose content close to 100%, the most natural source of pure cellulose. Generally wood, cellulose accounted for 40 50%, and 10 30% hemicellulose and 20 to 30% of the lignin. From 1996 the first identification of plant cellulose synthase gene, one of the research on cellulose synthesis in plants has passed the 10-year history. 10 years, people have achieved great results. Lignin is a component of plant cell wall composition, connected with the role of the cell. Lignin is a group containing many negatively charged polycyclic organic polymers, on the soil has strong metal ion affinity. Increasing depletion of fossil energy, lignin-rich reserves, the rapid development of science and decision lignin of lignin of the economic benefits of sustainable development. Lower cost of lignin, lignin and its derivatives with a variety of functionality can be used as dispersing agent, adsorbent / desorption agent, the oil recovery additive, asphalt emulsifiers. Cellulose and lignin on the most significant contribution to sustainable human development lies in providing a stable and sustainable source of organic matter, so its prospects are bright. This paper mainly cellulose and lignin synthesis in plants gene research paper. Keywords: Cellulose Lignin Regulation Gene Synthesis plant1.纤维素合成酶的研究纤维素是由-1,4葡萄糖残基组成的不分枝多糖,是植物细胞壁的主要成分,自然界中每年大约有1800亿吨的纤维素产物生成,具有较高的经济价值。因此 ,人们从不同角度致力于研究体外高效合成纤维素的新途径,从革兰氏阴性菌醋酸杆菌中发现了纤维素合成酶的激活因子cyclic diguanylic acid,进而导致纯化纤维素合成酶、克隆编码催化亚基的基因,调控纤维素微丝的分泌和结晶作用。1人们从利用细菌体外合成纤维素到研究纤维素的结构;从研究纤维素合成酶在纤维素合成中的作用,发展到如今重点研究植物纤维素生物合成中的基因调控、基因功能。1.1体外合成纤维素的研究20世纪50年代,Leloir等首次发现了UDP-葡萄糖,证明大分子物质能作为糖醛转移酶的受体,Glaeer确定了由醋酸杆菌制备的膜能合成有限的-1,4葡聚糖,并进一步证明这个特征在农杆菌和高等植物中都存在,反应可以用UDP葡萄糖作为合成纤维素的底物,同时需要Ca2+存在。以色列Hestrin小组是以醋酸杆菌为模式研究纤维素体外合成的先驱。2很多菌类都能合成纤维素。其中,醋酸杆菌属产生的纤维素量较大,而且是以分泌形式产生的,该小组建立了醋酸杆菌生产纤维素的最佳模式,发现了纤维素合成酶的激活因子cyclic dliguanylic acid,提出了一条体外高效合成纤维素的新途径,进而导致纤维素合成酶基因的克隆。31.2纤维素合成酶基因命名规则1982年,Benziman等人体外合成纤维素,该产物与在上述醋酸杆菌菌体内生成的相近。1990年,Browm实验室从醋酸杆菌中分离出一个编码催化亚基的基因AcsA。1990年,Wong等人用上述醋酸杆菌的纤维素缺陷突变体的遗传互补的方法分离了4个操纵子,BcsAD基因。4突变菌株的分析表明该基因AC对纤维素合成是必需的,BcsA基因与Ac-sA基因高度同源,也能编码催化亚基。当时,关于这些基因的命名比较混乱。Delmer制定了命名规则,用Ces代替Cellulose synthase,并将种属的名称加在前面。例如:Ax代表Acetobacter xylinum或Gh代表Gossypium hirsutum,如果基因后面有一个“A”表明它编码细菌催化亚基的同源体。因此,对醋酸杆菌来说,先前命名的BcsA或AscA将改为AxCesA,来自棉花的为GhCesA,“B”基因或AxCesB基因,操纵子中第二个基因,表明它是编码一个能结合C-d-Gmp的调控亚基。“C”基因或AxCesC基因,操纵子中第三个基因,Saxena等认为它编码一个革兰氏阴性菌气孔形成蛋白,纤维素在其中分泌,而植物中该蛋白不一定存在。“D”基因或AxCesD基因,操纵子中第四个基因,该基因在纤维素合成中起重要作用,在植物中与该基因同源序列尚未发现。植物纤维素合成酶基因基本遵循这个命名规则。51.3植物纤维素合成酶定位和功能运用免疫细胞化学方法发现,纤维素合成酶定位在质膜上。纤维素是所有高等植物细胞壁的主要成分。CesA蛋白在植物所有的组织和不同类型的细胞中都能表达。但是,这个基因家族中的不同成员在初生壁到次生壁形成中的表达是有差异的。运用棉花CesA蛋白中心区域的多克隆抗体技术证明质膜上具有玫瑰花状结构,该结构为植物纤维素合成酶复合体,质膜表面上的玫瑰花状结构是由6个大亚基组成一个六边形图案,每个大亚基大约9nm左右。该结构的发现证明了CesA基因在纤维素合成中的重要作用。6CesA蛋白的氨基端带有类似于锌指的区域,该区域在蛋白质与蛋白质相互作用中起着重要作用。并且该区域通过蛋白质配对或特异降解来行使CesA功能。纤维素合成酶的主要功能是产生纤维素多聚体-1,4葡萄糖链,大小在2 000到25 000葡萄糖残基,纤维素是植物原纤丝的基础,由36个葡萄糖链组成,有的藻类能产生1200葡萄糖链组成的大纤丝。71.4纤维素合成酶基因功能的研究运用遗传学手段进行CesA基因功能的研究成为该领域的研究重点,这些手段包括DNA微点阵、免疫细胞化学法、表达序列标签法(expressed sequence tags,ESTs)、点突变法、TDNA插入法和病毒诱导基因沉默法。拟南芥的12个不同的CesA基因就是利用EST方法鉴定出来的。因为基因家族中成员有可能催化相同的反应,我们面临的挑战就是确定CesA基因家族中的各个成员的表达模式和准确的功能。8Hol-land等人利用RTPCR对玉米植株不同部位的这些基因的mRNA进行半定量分析,实验以扩增肌动蛋白保守区域作为参照。结果表明每个基因表达的部位叶片和叶鞘、胚芽鞘、根尖,根伸长区和根毛分化区,每个基因在不同区域表达水平是不同的。Burton等人利有病毒诱导植物纤维素合成酶基因沉默的方法来研究CesA基因的功能,他们将与CesA基因相关的三个特异cDNA片段分别插入马铃薯X病毒载体中,将他们接种到烟草(Nicotiana benthamiana)上进行基因功能分析。9结果感染的植株表现出节间缩短,小叶和侏儒症状,叶表面由于缺少纤维素而表现为细胞膨胀,叶片的多聚糖含量降低了25%。CesA基因的转录水平降低,表明cD-NA片段沉默了一个或多个纤维素合成酶基因的表达。尽管纤维素合成酶基因的研究已取得了可喜的成绩,但是该领域还存在一些尚未解决的问题。102.木质素合成的研究进展木质素(Lignin)是维管植物进化过程中的一种结构产物之一,在细胞壁木质化程中,逐步渗入到细胞壁,填充于纤维素构架内,加大了细胞壁的硬度,增强了细胞的机械支持力或抗压强度,促进机械组织的形成,有利于巩固和支持植物体及水分输导等作用。11同时,由于木质素的不可溶性及多酚类物质等化学特性,也增强了植物的抗病能力;对用作燃料的木材来说,高木质素含量的木材能释放较多的热量。但从另一角度看,木质素对人类生产实践活动产生一些负面影响,如木质素含量的牧草会影响草食动物的消化;而对造纸用木材来说,木质素是影响造纸工艺和纸张质量的主要因素之一。目前国际上主要采用碱法造纸,为去除和回收木材中的木质素,需耗用大量的碱和硫酸等化学物质,不但增加了生产成本,同时还由于所使用的大量的化学药品而会给环境造成严重的污染。鉴于此,人们试图研究通过基因工程的手段来调控木材中木质含量,以培育木质素含量低的转基因新品种。122.1木质素的种类和分布木质素在木材中是仅次于纤维素的主要成份,是由三种醇单体或单木质酚如香豆醇、松柏醇和芥子醇等合成的一种复杂的酚类聚合物。通常占木材干重的15%36%,贮存于次生厚组织中,与植物的硬度和防水作用密切相关。木质素不是单一的结构,而是一组相关联的苯基丙烷单元称为木质素单体(monolignol),通过一定方式聚合一起的总称,是芳香类物质的高聚物,到目前为止尚未有任何办法能从植物中分离出完全没有变化的原木质素。13其单体主要分为:由香豆醇衍生的对苯基单体(H型)、由松柏醇衍生的愈创木基单体(G型)和由芥子醇衍生的紫丁香基单体(S型)等三类。H型主要存在于禾本科植物中,S型主要存在于被子植物中,G型则广布于裸子植物和被子植物中。14木质素是属细胞壁的次生结构之一,主要贮存于细胞中,其结构方式和含量依不同的种类、个体、组织、细胞类型、细胞层以及环境条件而变化的,在垂直分布上木质素含量随高度的增加而逐渐降低;在径向分布上对针叶树是心材比边材少、秋材比春材少,而在阔叶树中则没有显著差异。152.2木质素生物合成途径木质素的生物合成虽然未完全清楚,但经过多年的研究,普遍认为大致可分为3个步骤:(1)首先是植物光合作用后的同化产物到芳香氨基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等的合成过程,称为莽草酸途径。(2)其次是从苯丙氨酸到羟基肉桂酸(HCA)及其辅酶A酯类,称为苯丙酮酸途径。(3)最后是从羟基肉桂基辅酶A酯类到合成木质素单体及其聚合物的过程,称为木质素合成的特异途径。16在木质素合成的过程中有很多的酶参与作用,参与第二阶段的苯丙氨酸途径中有:肉桂酸4-羟基裂解酶(C4H)、咖啡酸5-羟化基阿魏酸0-甲基转移酶等。17参与第三阶段的木质素单体合成特异途径的酶主要有:香豆醇辅酶A降解酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)两种,但在多途径中还发现了松柏醛5-羟基降解酶(CAld5H)和松柏醛甲基转移酶(AldOMT)等。最后,在过氧化物酶(peroxi-dase)和漆酶(Laccase)等的催化下,各种木质单体聚合成为木质素。182.3木质素生物合成的基因调控2.3.1木质素生物合成基因调控策略木质素生物合成途径,可通过对不同酶的活性的改变实现对木质素生物合成的调控。:1.是通过降低木质素生物合成途径中的一些酶如CCR、CAD等酶的活性,调控木质素单体的合成过程,以达到降低木质素含量的目的。2.是由通过调节特定酶的活性来影响木质素的组成及化学结构。一般认为愈创木基单体(松柏醇聚合物)与紫丁香基单体(芥子醇聚合物)聚合成的G-S型木质素比纯粹由愈创木基单体聚合成的G型木质素易于降解,所以激活CAld5H和AldOMT酶的活性,与CAD竞争底物松柏醛,通过芥子醛合成更多的紫丁香基S型木质素单体,从而相对降低愈创木基的G型单体的合成的目的。192.3.2木质素生物合成基因调控研究现状在木质素生物合成基因调控中,首先要找到与木质素合成相关的生物酶并进行分离,然后分析其酶蛋白氨基酸序列,由此得到其mRNA的序列,也即功能基因外显子的编码序列。基因导入的方法则主要有农杆菌介导间接转化和基因枪直接转移两种。在调控酶活性的方面,通过构建反义基因进行转化和获得自然或人工突变体等。而且,由于木质素的生物合成涉及的酶很广,人们除研究单个基因的调控外,也试图对两个或多个基因的调控进行研究。2.3.3木质素生物合成相关基因的分离和克隆木质素调控的主要因素是得到编码木质素生物合成过程中的关键酶蛋白序列的基因,所以在研究木质素生物合成途径的过程中,也会分离出很多有关的酶蛋白,得到其氨基酸编码的基因序列。最早报道的是Dougalas等从皱叶欧芹(Petroselinum cripum)中克隆出的两个4CL基因:pc4CL-1和pc4CL-2。据不完全统计,至今已在20余种植物中克隆出了122个不同的基因或cDNA。202.3.4反义技术调控反义技术,也称反义DNA或反义RNA。是将构建或扩增好的反义DNA或反义RNA以特定方法导入生物体内,由外源反义mRNA或经过反义DNA转录来的反义mRNA,通过与体内的正义mRNA结合形成双链体,阻止正义mRNA从核内转运和与核糖体结合,来抑制体内天然正义基因的表达、以达到转调控目标基因的目的。反义技术是生物基因工程上应用较多的前沿技术之一,具有操作简便、特异强和安全性好等特点,主要用于性质改良和疾病治疗等。将反义技术用于林木木质素调控,通过构建与木质素合成酶基因反义的寡核苷酸序列,采用直接或间接方法转化进植株中,与植物体内的正义基因相互作用,影响目标酶蛋白的翻译或降低其活性,从而达到调控木质素的含量或结构组成的目的。这是目前木质素调控基因工程研究最常用并较有成效的转基因育种技术方法之一。Baucher等将从毛果杨美洲黑杨中分离出来的CAD酶的cDNA通过农杆菌进行有正义和反义的转化到欧洲山杨银白杨中,结果表明有3个反义转化和2个共抑制的品系的木质部组织的CAD酶活性下降70%。21在CAD活性降低少于60%的品系中,可检测到红色的木质部,但木质素含量与对