工艺技术_微生物酶制剂生产工艺及在食品工业中的应用

微生物酶制剂生产工艺及其在食品工业中的应用 制作人 冯华炜 目录 微生物酶制剂的简介微生物酶制剂的生产技术微生物酶制剂在食品工业中的应用 一 简介 1 定义酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质 酶制剂主要作用是催化食品加工过程中各种化学反应 改进食品加工方法 是一类从动物 植物 微生物中提取具有生物催化能力的蛋白质 微生物酶制剂就是从微生物中提取的蛋白质 2 微生物酶生产发展概况 1894年 日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶 并将淀粉酶用作治疗消化不良的药物 从而开创了人类有目的地生产和应用酶制剂的先例 1911年 美国科学家从木瓜中提取出木瓜蛋白酶 并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物 此后 酶制剂的生产和应用就逐步发展起1949年 科学家成功地用液体深层发酵法生产出了细菌 淀粉酶 从此揭开了近代酶工业的序幕 1971年 第一次国际酶工程学术会议在美国召开 会议的主题就是固定化酶的研制和应用 20世纪70年代后期 酶工程领域又出现了固定化细胞技术 1986年 我国科学家利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功 为酶工程的进一步发展开辟了新的途径 近20年来 随着基因工程的渗入 使酶的定向改造成为可能 所以在固定化酶 固定化细胞和固定化原生质体发展的同时 酶分子修饰技术 酶的化学合成以及酶的人工合成等方面的研究 也在积极地开展中 从而使酶工程更加显示出广阔而诱人的前景 3 利用微生物提取酶制剂的意义及其优点酶是一种生物催化剂 催化效率高 反应条件温和和专一性强等特点 已经日益受到人们的重视 应用也越来越广泛 生物界中已发现有多种生物酶 在生产中广泛应用的仅有淀粉酶 蛋白酶 果胶酶 脂肪酶 纤维素酶 葡萄糖异构酶 葡萄糖氧化酶等十几种 利用微生物生产生物酶制剂要比从植物瓜果 种子 动物组织中获得更容易 因为动 植物来源有限 且受季节 气候和地域的限制 而微生物不仅不受这些因素的影响 而且种类繁多 生长速度快 加工提纯容易 加工成本相对比较低 充分显示了微生物生产酶制剂的优越性 利用微生物产酶的优点是 1 微生物种类多 酶种丰富 且菌株易诱变 菌种多样 2 微生物生长繁殖快 易提取酶 特别是胞外酶 3 微生物培养基来源广泛 价格便宜 4 可以采用微电脑等新技术 控制酶发酵生产过程 生产可连续化 自动化 经济效益高 5 可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术 选育菌种 增加酶产率和开发新酶种 二 微生物酶的生产技术 二级种子 一级种子 三角瓶种子 斜面菌种 培养基 灭菌 接种 固体发酵 液体发酵 空气 压缩 过滤 浓缩酶液 干燥 酶粉 提取酶液 图1 微生物酶制剂的生产工艺 一 产酶微生物生产酶制剂的微生物有丝状真菌 酵母 细菌3大类群 主要是用好气菌 几种主要工业酶的菌种和使用情况如下 淀粉酶类 蛋白酶 葡糖异构酶 其他重要工业用酶 二 酶的生产方法酶的生产是指经过预先设计 并且通过人工控制而获得所需要的酶的过程 概括地说 酶的生产方法有提取法 发酵法和化学合成法三种 提取法是最早采用并且一直沿用至今的一种方法 它采用各种技术 直接从动植物或微生物的细胞或组织中将酶提取出来 提取法虽简单易行 但必须要有充足的原材料 这就使提取法的广泛应用受到了限制 发酵法是20世纪50年代以来生产酶的主要方法 它主要通过微生物发酵来获得人们所需要的酶 发酵法一般包括固体发酵 液体深层发酵 固定化细胞发酵和原生质体发酵等多种方式 化学合成法是20世纪60年代末出现的一种生产酶的新技术 目前仍然停留在实验室内合成的阶段 1 菌种选择微生物发酵生产酶的方法同其他发酵行业类似 首先必须选择合适的产酶菌株 然后采用适当的培养基和培养方式进行发酵 使微生物生长繁殖并合成大量所需的酶 最后将酶分离纯化制成一定的酶制剂 三 微生物酶制剂生产 任何生物都能在一定的条件下合成某些酶 但并不是所有的细胞都能用于酶的发酵生产 一般说来 能用于酶发酵生产的细胞必须具备如下几个条件 酶的产量高优良的产酶细胞首先具有高产的特性 才有较好的开发应用价值 高产细胞可以通过筛选 诱变 或采用基因工程 细胞工程等技术而获得 容易培养和管理 要求产酶细胞容易生长繁殖 并且适应性较强 易于控制 便于管理 产酶稳定性好在通常的生产条件下 能够稳定地 用于生产 不易退化 一旦细胞退化 要经过复壮处理 使其恢复产酶性能 利于酶的分离纯化发酵完成后 需经分离纯化过程 才能得到所需的酶 这就要求产酶细胞本身及其它杂质易于和酶分离 安全可靠要使用的细胞及其代谢物安全无毒 不会影响生产人员和环境 也不会对酶的应用产生其它不良的影响 2 产酶培养酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的 为此 除了选择性能优良的产酶细胞以外 还必须满足细胞生长 繁殖和发酵产酶的各种工艺条件 并要根据发酵过程的变化进行优化控制 1 固体培养法固体培养是以麸皮或米糠为主要原料 另外添加谷糠 豆饼等为辅助原料 经过对原料发酵前处理 在一定的培养条件下微生物进行生长繁殖代谢产酶 固体培养法比液体培养法产酶量高 同时还具有原料简单 不易污染 操作简便 酶提取容易 节省能源等优点 缺点是不便自动化和连续化作业 占地多 劳动强度大 生产周期长 2 液体培养法液体培养法的优点是 占地少 生产量大 适合机械化作业 发酵条件容易控制 不易污染 还可大大减轻劳动强度 其培养方法有分批培养 流加培养和连续培养三种 其中前两种培养法广为应用 后者因污染和变异等关键性技术问题尚未解决 应用受到限制 3 产酶条件的控制 1 培养基培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料 主要是碳源 氮源 其次是无机盐 生长因子和产酶促进剂等 碳源碳素是构成菌体成分的主要元素 也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架 还是菌体生命活动的能量的主要来源 当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有机碳的异养型微生物 有机碳的主要来源有 一是农副产品中如甘薯 麸皮 玉米 米糠等淀粉质原料 二是野生的如土茯苓 橡子 石蒜等淀粉质原料 不同的细胞对各种碳源的利用差异很大 所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源 另外 选择碳源除考虑营养要求外 还要考虑酶生物合成的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用 尽量选用具有诱导作用的碳源 尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源 例如 淀粉酶的发酵生产中 应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源 而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源 氮源氮是生物体内各种含氮物质 如氨基酸 蛋白质 核苷酸 核酸等的组成成分 酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种 常用的有机氮源有 豆饼 花生饼 菜籽饼 鱼粉 蛋白胨 牛肉膏 酵母膏 多肽 氨基酸等 无机氮源有 NH4 2SO4 NH4Cl NH4NO3 NH4 3P04 尿素等 不同的细胞对各种氮源的要求各不相同 应根据要求进行选择和配制 一般来说 动物细胞要求有机氮 植物细胞主要要求无机氮 多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果 例如黑曲霉酸性蛋白酶生产 只用铵盐或硝酸盐为氮源时 酶产量仅为有胨时的30 只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低 故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加1 3 的无机氮源 碳氮比在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类 生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的 一般蛋白酶 包括酸性 中性和碱性蛋白酶 生产采用碳氮比低的培养基比较有利 例如黑曲霉3 350酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3 75 玉米粉0 625 鱼粉0 625 NH4Cl1 CaCl20 5 Na2HP040 2 豆饼石灰水解液10 组成的培养基 淀粉酶 包括 淀粉酶 糖化酶 淀粉酶等 生产的碳氮比一般比蛋白酶生产略高 例如枯草杆菌TUD127 淀粉酶生产采用由豆饼粉4 玉米粉8 Na2HP040 8 NH4 2SO40 4 CaCl20 2 组成的培养基 而在淀粉酶生产中糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的 以上是蛋白酶和淀粉酶生产培养基碳氮比的一般规律 但是由于菌种很多而其性质各异 很难说都是符合上述规律的 在微生物酶生产过程中 培养基的碳氮比也因培养过程不同而异 例如种子培养时 为了适应菌体生长繁殖的需要 要求提供合成细胞蛋白质的氮多些 容易利用的氮源的比例大些 种子培养基的碳氮比一般要比发酵培养基低些 发酵时 不同发酵阶段要求的碳氮比也是不同的 例如在枯草杆菌BF 7658生产 淀粉酶的发酵过程中 发酵前期要求培养基的碳氮比适当降低 以利菌体生长繁殖 发酵中后期要求培养基的碳氮比适当提高 以促进淀粉酶的生成 无机盐微生物酶生产和其他微生物产品生产一样 培养基中需要有磷酸盐及硫 钾 钠 钙 镁等元素存在 在酶生产中常以磷酸二氢钾 磷酸氢二钾等磷酸盐作为磷源 以硫酸镁为硫源和镁源 钙离子对淀粉酶 蛋白酶 脂肪酶等多种酶的活性有十分重要的稳定作用 例如在无Ca2 存在时灰色链霉菌中性蛋白酶只在pH7 7 5很小范围内稳定 当有Ca2 存在时稳定pH范围可以扩大到5 7 钠离子有控制细胞渗透压使酶产量增加的作用 酶生产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入 例如米曲霉 淀粉酶生产 添加适量的硝酸钠以促进酶生产 在天然培养基中 一般微量元素不必另外加入 但也有一些例外 如玉米粉 豆粉为碳源时 添加100ppmCo2 和Zn2 放线菌166蛋白酶活力可增加70 80 生长因子微生物还需一些微量的像维生素一类的物质 才能正常生长发育 这类物质统称生长因子 或生长素 其中包括某些氨基酸 维生素 嘌呤或嘧啶等 酶制剂生产中所需的生长因子 大多是由天然原料提供 如玉米浆 麦芽汁 豆芽汁 酵母膏 麸皮 米糠等 玉米浆中一般含有生长素32 128mg mL 产酶促进剂产酶促进剂是指在培养基中添加某种少量物质 能显著提高酶的产率 这类物质称为产酶促进剂 产酶促进剂大体上分为两种 一是诱导物 二是表面活性剂 表面活性剂 如吐温 80的浓度为0 1 时能增加许多酶的产量 表面活性剂能增加细胞的通透性 处在气 液界面改善了氧的传递速度 还可以保护酶的活性 生产上常采用非离子型表面活性剂 如聚乙二醇 聚乙烯醇衍生物 植酸类 焦糖 羧甲基纤维素 苯乙醇等 离子型的表面活性剂对微生物有害 用于食品 医药的酶 的生产中所用的表面活性剂还须对人 畜无害 此外各种产酶促进剂的效果还受到菌种 种龄 培养基组成的影响 酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能的影响外 还受到发酵温度 pH 溶氧量等条件的影响 2 培养条件发酵温度发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应 发酵中通风 搅拌速度的变化而变化的 微生物在生长发育中 不断地吸收培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都是吸热反应 培养基中的营养物质被大量分解时的生化反应都是放热反应 发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量 发酵液需要升温 当菌体繁殖旺盛时 情况则相反 发酵液温度就自行上升 加上通风搅拌所带来的热量 这时 发酵液必须降温 以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度 微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性质不同而异 生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致 一般细菌为37 霉菌和放线菌为28 30 一些嗜热微生物需在40 50 下生长繁殖 如红曲霉生长温度35 37 而生产糖化酶的最适温度为37 40 在酶生产中 为了有利于菌体生长和酶的合成 也有进行变温生产的 例如以枯草杆菌ASl 398进行中性蛋白酶生产时 培养温度必须从31 逐渐升温至40 然后再降温到31 进行培养 蛋白酶产量比不升温者高66 据报道 酶生产的温度对酶活力的稳定性有影响 例如用嗜热芽孢杆菌进行 淀粉酶生产时 在55 培养所产生的酶的稳定性比35 好 种子培养基和发酵培养基的pH直接影响酶的产量和质量 在发酵过程中 微生物不断分解和同化营养物质 同时排出代谢产物 由于这些产物都与pH有直接关系 因此发酵液pH在不断发生变化 生产上根据pH的变化情况常作为生产控制的根据 一般来说 培养基成分中碳 氮 C N 比高 发酵液倾向于酸性 pH低 C N低 发酵液倾向于碱性 pH高 pH的这些变化情况 常常引起细胞生长和产酶环境的变化 对产酶带来不利的影响 因此生产中常采用一些控制pH的方法 通常有 添加缓冲液维持一定的pH 调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围 调节培养基的初始pH 保持一定的C N比 当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节 pH过低时 通过氮调节 pH对产酶的影响 通风量对产酶的影响其实通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定 一般来说 在发酵初期 虽然幼细胞呼吸强度大 耗氧多 但由于菌体少 相对通风量可以少些 菌体生长繁殖旺盛期时 耗氧多 要求通风量大些 产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异 一般需要强烈通风 但也有例外 通风量过多反而抑制酶的生成 因此 菌种 酶种 培养时期 培养基和设备性能都能影响通风量 从而影响酶的产量 目前用于酶制剂生产的微生物都为好气性微生物 生产上普遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表 搅拌的影响对于好气性微生物的深层发酵 除了需要通气外 还需要搅拌 搅拌有利于热交换 营养物质与菌体均匀接触 降低细胞周围的代谢产物 从而有利于新陈代谢 同时可打破空气气泡 使发酵液形成湍流 增加湍流速度 从而提高溶氧量 增加空气利用 但搅拌速度主要因菌体大小而异 由于搅拌产生剪切力 易使细胞受损 同时搅拌也带来一定机械热 易使发酵液温度发生变化 搅拌速度还与发酵液黏度有关 泡沫的影响发酵中往往产生较多的泡沫 泡沫的存在阻碍了CO2的排除 影响溶氧量 同时泡沫过多影响补料 也易使发酵液溢出罐外造成跑料 因此 生产上必须采用消泡措施 一般除了机械消泡外 还可利用消泡剂 消泡剂主要是一些天然的矿物油类 醇类 脂肪酸类 胺类 酰胺类 醚类 硫酸酯类 金属皂类 聚硅氧烷和聚硅酮 其中以聚甲基硅氧烷最好 我国常用聚氧丙烯甘油醚或泡敌 聚环氧丙环氧乙烷甘油醚 理想的消泡剂 其表面相互作用力应低 而且应难溶于水 还不能影响氧的传递速率和微生物的正常代谢 湿度用固体培养基生产酶制剂时 一般前期湿度低些 培养后期湿度大些 有利于产酶 3 分离提纯 微生物酶的提取方法 因酶的结合状态与稳定性的不同 应用部门对产品的纯度要求不同 而有一定的区别 1 盐析法盐析剂中性盐的选择 MgS04 NH4 2S04 Na2SO4 NaH2P04是常用的盐析用中性盐 NH4 2S04是最多用的盐析剂 这是因为它的溶解度在较低温度下也是相当高的 在无盐或稀盐溶液中 温度低 蛋白质的溶解度也低 但在高浓度盐溶液中 温度高则蛋白质的溶解度反而低 因此一般说来盐析时不要降低温度 除非这种酶不耐热 2 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质的种类及有机溶剂的种类而不同 对曲霉淀粉酶而言 有机溶剂的沉淀能力 丙酮 异丙醇 乙醇 甲醇 这个顺序还受温度 pH 盐离子浓度所影响 不是一成不变的 3 吸附法 白土及活性氧化铝吸附法白土类是以硅酸铝为主要成分的粘土 随其种类不同 能吸附酶或蛋白质的种类和数量也不同 一般在弱酸性条件下吸附酶或蛋白质 在中性或弱碱性条件下解吸 白土先用2mol L盐酸活化 活性氧化铝也是最常用的吸附酶或蛋白质的吸附剂之一 可以用明矶 硫酸铵等调制 加热使之活性化 酶或蛋白质一般在弱酸性条件下吸附 在弱碱性条件下解吸 淀粉吸附 淀粉酶的方法一定的酶只作用于特定的基质 这一事实说明两者之间有一种特别的亲和力 因此用基质吸附那种对基质具有特定作用的酶 可以达到很好的效果 但作为吸附剂的基质首先必须是固相物 其次在吸附酶的过程中 这种基质不会被它所吸附而又专门能作用于它的酶所分解 或分解程度极微 第三是单位重量的基质吸附这种特定酶的能力均应该足够大 现发现生淀粉对 淀粉酶的吸附是比较接近于上述条件的 4 酶制剂化和稳定化处理浓缩的酶液可制成液体或固体酶制剂 酶制剂的出售是以一定体积或重量的酶活计价 所以生产出的酶制剂在出售前往往需要稀释至一定的标准酶活 同时为改进和提高酶制剂的储藏稳定性 一般都要在酶制剂中加入一种以上的物质 它们既可作酶活稳定剂 又可作抗菌剂及助滤剂 它们若制成干粉 则可起到填料 稀释剂和抗结块剂的作用 可用作酶活稳定剂的物质很多 如辅基 辅酶 金属离子 底物 整合剂 蛋白质等 最常用的有多元醇 如甘油 乙二醇 山梨醇 聚乙二醇等 糖类 食盐 乙醇及有机钙 有时用一种稳定剂效果不明显 则需要几种物质合用 如明胶对细菌淀粉酶及蛋白酶有稳定作用 但效果不明显 若同时加人些乙醇和甘油 稳定效果就显著了 四 酶制剂在食品工业中的应用 酶制剂在食品保鲜方面的应用酶法保鲜技术是利用生物酶的高效的催化作用 防止或消除外界因素对食品的不良影响 从而保持食品原有的优良品质和特性的技术 主要用于食品保鲜中的酶制剂有葡萄糖氧化酶 Glucoseoxidase 和溶菌酶 酶制剂在淀粉类食品生产中的应用淀粉可以通过水解作用生成糊精 低聚糖 麦芽糊精和葡萄糖等产物 这些产物又可进一步转化为其他产物 在这些产物的生产中 已广泛应用各种酶 在淀粉类食品的加工中 多种酶被广泛地应用 其中主要的有a 淀粉酶 淀粉酶 糖化酶 支链淀粉酶 葡萄糖异构酶等 现在国内外葡萄糖的生产绝大多数是采用淀粉酶水解的方法 酶法生产葡萄糖是以淀粉为原料 先经a 淀粉酶液化成糊精 再利用糖化酶生成葡萄糖 果葡糖浆是有葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成果糖 而得到含有葡萄糖和果糖的混合糖浆 若将异构化反应完成后 混合糖液经过脱色 精制 浓缩等过程 得到固形物含量达71 左右的果葡糖浆 其中 含果糖42 左右 含葡萄糖52 左右 另有6 左右为低聚糖 若将异构化后的混合糖液中的果糖与葡萄糖分离 再将分离的葡萄糖进行异构化 如此反复进行 可使更多的葡萄糖转化为果糖 由此可生产出果糖含量达70 90 甚至更高的果葡糖浆 称之为高国糖浆 此外在饴糖 糊精的生