第03章 高效液相色谱法.ppt

1 第三章高效液相色谱法 第一节高效液相色谱法第二节主要分离类型与原理第三节液相色谱的固定相与流动相第四节影响分离的因素与操作条件的选择第五节制备型液相色谱第六节高效毛细管电泳 2 第六节高效毛细管电泳一 高效毛细管电泳仪器 3 4 5 二 高效毛细管电泳基本原理在电解质溶液中 位于电场中的带电离子在电场力的作用下 以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象 称之为电泳 由于不同离子所带电荷及性质的不同 迁移速率不同可实现分离 经典电泳分离法的不足 所用分离柱的柱径大 柱较短 分离效率不高 远低于HPLC 温度影响大 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进 6 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进 一是采用了0 05mm内径的毛细管 二是采用了高达数千伏的电压 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发 大大减小了温度效应 使电场电压可以很高 电压升高 电场推动力大 又可进一步使柱径变小 柱长增加 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱 理论塔板数高达几十万块 米 特殊柱子可以达到数百万 7 电泳现象与电渗流现象电泳现象 带电离子在电场作用下的迁移 速度v电泳电渗流现象 玻璃表面存在硅羟基 pH 3时 形成双电层 在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动 速度v电渗流 8 分离过程 电场作用下 柱中出现 电泳现象和电渗流现象带电粒子的迁移速度 电泳和电渗流两种速度的矢量和正离子 两种效应的运动方向一致 在负极最先流出中性粒子无电泳现象 受电渗流影响 在阳离子后流出阴离子 两种效应的运动方向相反 v电渗流 v电泳时 阴离子在负极最后流出 在这种情况下 不但可以按类分离 除中性粒子外 同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离 9 分离类型1 毛细管区带电泳 CZE 最普遍 最基本的一种分离模式 2 毛细管凝胶电泳 CGE 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶 其具有多孔性 类似分子筛的作用 试样分子按大小分离 能够有效减小组分扩散 所得峰型尖锐 分离效率高 可分离测定蛋白质 DNA等 10 3 毛细管胶束电动色谱 MECC 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂 形成一疏水内核 外部带负电的胶束 在电场力的作用下 胶束在柱中移动 由于电泳流和电渗流的方向相反 且v电渗流 v电泳 则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动 中性试样分子在胶束相和溶液 水相 两相间分配 疏水性强的组分与胶束结合的较牢 流出时间长 可用来分离中性物质 扩展了高效毛细管电泳的应用范围 11 12 三 仪器装置 电压 0 30KV 分离柱不涂敷任何固定液 紫外或激光诱导荧光检测器 可检测到 10 19 10 21mol L 13 四 影响柱效的因素及改进方法 热效应 焦耳热是影响柱效的主要因素 采用外部冷却的方法散热 选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径 选择合适的电解质降低电阻 电流低于200微安 一般几十微安 电渗流控制 电渗流的大小和方向 依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小 使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向 如添加NaCl和甲醇可降低电渗流 加入乙腈则可以增大电渗流 加入反转剂 则可以改变电渗流的方向 14 五 主要特点和应用 高分辨率 理论塔板数高达数百万块 甚至数千万块 高灵敏度 可检测出低至10 21mol L浓度的物质 高分析速度 可在3分钟内分离30种阴离子 1 7分钟分离19种阳离子 4分钟可分离10种蛋白质 试样用量少 仅需几nL 10 9L 的试样仪器简单 操作成本低 分析一个试样仅需几毫升流动液 不足之处 进样不够方便 应用范围相对较窄 15 第七节纸层析和薄层层析法一 纸层析和薄层层析分离过程纸层析和薄层层析也属于色谱分析法 但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源 纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用 将试样点在色谱滤纸或层析板的一端 并将该端浸在作为流动相的溶剂 常称之为展开剂 中 随着溶剂向上的移动 经过试样点时 带动试样向上运动 16 比移值 17 18 二 操作技术 层析纸和层析板 特制的色层滤纸 按需要剪裁成长条形 或筒型 层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂 硅胶或氧化铝 200 250目 均匀地涂在长条形玻璃板上 厚度0 15 0 5mm 干燥后即可使用 19 1 展开剂展开剂 由一种或多种溶剂按一定比例组成 如用纸层析分离氨基酸时 常用的展开剂组成和配比为 正丁醇 乙酸 水 4 1 1 20 2 点样点样 用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上 试样点的直径一般应小于5mm 可并排点多个试样同时展开 21 3 显色检测有些组份在紫外光照射下产生荧光 可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来 常用的显色方法 喷洒显色剂 碘蒸气熏或氨水熏等 22 三 特点及应用优点 平板色谱简单 方便 及操作费用低 可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开 采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开 即按一般方法展开后 改变方向和展开剂再次展开 进一步改善分离效果 试样一般不需要经过预处理即可分离 23 缺点 分离效