第七章 抗体酶.doc

第七章 抗体酶抗体与酶的异同：相同点：都是蛋白质，都有特异性。不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。抗体酶（abzyme、catalytic antibody） 抗体酶首先是抗体，具有高度选择性，同时又具有酶提高化学反应速度。所以抗体酶赋予抗体分子和酶两个不同的属性。一、抗体酶研究背景 1948年Linus Pauling提出了酶的过渡态催化理论，被认为酶和底物结合不是在基态上，因为酶与基态底物的结合十分困难，需要克服很大的能障。过渡态结构十分容易与酶结合，因为酶结构经过底物诱导等，亲和力最强。十分容易越过能障，加速催化速度。所以，酶具有催化速度快和高选择性。而抗体的特征是多样性和专一性，被认为一种抗原产生108种不同的抗体，抗体和抗原的专一结合超过了酶的专一性，抗体酶专一性更高。酶的专一性在生物进化上演化了上百万年，抗体的专一性的形成只需要几个星期而已。 现在我们可以借助物理和合成化学的发展，利用免疫系统巨大的细胞和分子网络产生催化抗体。在7080年代，W.P.Jencks预言，抗某个反应过渡态的抗体具有催化该反应的能力。 1975年前后，抗体酶处于探索的开始阶段，一般采用诱导法、引入法进行尝试，一般效率很低，有的还测定不出活性。 1975年时，G.Kohler & C.Milstein 发明了单克隆抗体技术后，就有了后来的抗体酶。1986年，美国的Schultz小组研究“对硝基苯酚磷酸胆碱脂（pNPPC）”相应的羧酸二酯水解反应的过渡态类似物时，推测用这个过渡态类似物作半抗原。这样的分析，后来的确从中选出了两株有催化活性的单克隆抗体，一株MOPC167的水解速度达到了1.2x103倍。经过测定，这个抗体酶符合米氏方程，具有底物专一性、pH和需要一定的温度等酶的催化特征。结果表明底物类似物的结构与抗体酶有关。另一实验：合成一个含吡啶甲酸的磷酸酯化合物用这个过渡态类似物作半抗原免役小鼠，得到12株单抗。结果：3株有抗体酶活性，其中一株6D4能与半抗原分子结合外，还能催化不含吡啶甲酸的相应磷酸酯化合物水解，速度快103倍，具有底物专一性和对pH的依赖性。用半抗原可以竞争性地抑制这个反应。还发现单抗的结合位点的氨基酸改变，可以影响它的催化活性。抗体酶的特点： 在专一性方面超过或相当于我们讲的普通酶。 在反应速度方面接近普通酶。更多的为低些的抗体。 原因：因为抗体酶没有结构的诱导等动态变化；产物释放困难；底物、产物的交换困难等。1、能催化一些天然酶不能催化的反应q 有许多化学反应还没有已知酶催化进行q 抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性q 抗体酶可以根据需要人工裁制 抗体酶的催化反应类型 u 转酰基反应u 水解反应u Claisen重排反应u 酰胺合成反应u Diels-Alder反应u 转酯反应u 光诱导反应u 氧化还原反应u 脱羧反应u 顺反异构化反应2、有更强的专一性和稳定性q 抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子q 抗体酶催化反应的介质效应半抗原：一类小分子化合物，本身不能诱导免疫应答，只有当它共价结合到具有免疫性的蛋白质后，注射动物才能诱导小分子物质的抗体产生。设计抗体酶的通用模式： 设计一个在空间上和电荷上都与反应过渡态结构相似的稳定分子，以此分子做半抗原与一载体蛋白共价结合，免疫、诱导产生能结合该半抗原且能催化与半抗原相应的底物分子转化的抗体克隆，其底物专一性通过对半抗原结构的调整来实现。1、半抗原设计中应考虑：(1) 产生的抗体能否具有预期的催化活性。 (2) 能否刺激机体免疫应答。2、半抗原结构与催化抗体之间的关系：(1) 半抗原结构中应含有芳香结构（具较强的免疫原）。(2) 催化抗体和半抗原的亲和力。(3) 诱导羧酸酯、酰胺水解的催化性抗体，可利用其具有四面体结构的高能过渡态类似物为抗原。(4) 半抗原设计应考虑催化反应的环境与反应机制。二、抗体酶如何生产？ 1、拷贝法：用已知的酶作为抗原对动物进行第一次免疫，获得抗酶抗体；再用抗酶抗体作为抗原进行第二次免疫获得抗抗体，抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。 优点:可以大量生产单克隆抗体酶 缺点:有相当大的盲目性和偶然性，并不能产生新酶。2. 诱导法或者细胞融合法： 先用特定的半抗原(过渡态底物决定)与载体蛋白相连(如牛血清白蛋白等)，此偶联的物质作为抗原 免疫动物，产生抗体 产生抗体的脾脏细胞与骨髓融合，然后在体外培养，杂交体克隆化，然后繁殖成单一细胞或菌落单一细胞或菌落产生抗体。用标准单克隆抗体技术来制备、分离、筛选抗体酶。我们知道过渡态复合物是个不稳的中间态形式，有些只是理论推测，其结构我们还不知道，所以这里第一步是正确的过渡态复合物的设计。如酯水解的过渡态复合物是个带电的四面体结构，想法设计一个带电的磷酸酯为过渡态复合物，其中苯基和苯酚基可以改变，也就可以制造各种结合专一性抗体酶。例子：用一个环化的磷酸酯做过渡态类似物免疫兔子，得到催化外消旋的羟基羧酸酯分子内环化形成内酯；不但速度快，而且产物中一种对映体含量高94%，就因为有了抗体酶的加入。3引入法(辅助因子）： 是用选择性的化学修饰、基因工程或者蛋白质工程方法，将催化基团和辅助因子引入抗体的抗原结合部位。 Schultz等人在IgAMOP315抗体结合部位选择性引入巯基，然后用亲和色谱纯化。结果：它水解香豆酯的速度比对照高6103倍。 酶的活性中心很多有金属离子。Lerner等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，半抗原分子带有一肽键，通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连，再共价连接在载体蛋白上，免疫动物后产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键，其转化数达6104。4. 用生物工程的方法产生抗体 Scripps研究院的研究人员开创了一项技术-在体外制造抗体片断即Fab片断，然后组成催化剂。抗体酶有这样的片断就行，无须完整的抗体分子。 用抗原免疫小鼠，分离经诱导产生抗体的重链基因 从小鼠基因文库中取得轻链基因， 轻、重链基因重组 导入E.coli，表达基因产物 从基因产物中分离、筛选抗体酶（抗体酶的轻链与金属离子结合并发挥催化作用，重链负责识别抗原） 该法的意义在于可研制小分子化合物为辅因子的抗体酶三、抗体酶的辅因子在抗体的抗原结合位点引入辅因子的方法目前有三种：1、用多种底物类似物一次免疫动物，产生既有辅因子结合部位又有底物结合部位的抗体。2、用半合成法将辅因子或催化基团引入到抗体底物结合部位。3、向抗体中的一条链的抗原结合部位引入辅因子。四、抗体酶研究的方向问题：1) 虽然有了不少抗体酶，但对诱导方法而言，需要寻找一个最为可能诱导出抗体酶的过渡态复合物，且这是一个最为困难的问题。根本原因是酶催化反应有很多不清楚。所以寻找抗体酶的过渡态复合物是研究的一个重要方面。2) 通过抗体酶来研究酶的作用机理，以及为过渡态复合物设计提供理论依据，从而指导抗体酶的设计。3）通过对抗体酶本身的进一步研究，搞清蛋白质结构和功能的关系问题。4）通过抗体酶的制备来制造一些新的原先没有的新酶。5）设计有治疗价值的新药物。如利用抗体酶基因来治疗遗传性疾病。6）抗体酶的固定化