蛋白质表达：带GST标签蛋白的纯化.doc

产品使用说明书GSTBind 纯化试剂盒试剂盒简介以下货号试剂和试剂盒均可参照此说明书操作：建议同时参考本说明书英文原文（说明书编号TB235）。GSTBind树脂：10ml 货号70541-3，50ml 货号70541-4，25ml 货号70541-5GSTBind缓冲液试剂盒：货号70534-3BugBuster GSTBind纯化试剂盒：货号70794-3GSTBind树脂GSTBind树脂用于一步法亲和层析纯化融合表达谷胱甘肽S转移酶（GST）的目的蛋白或天然GST或谷胱甘肽结合蛋白，操作方便快捷。GSTTag融合表达蛋白带有220个氨基酸的GST标签（如表达自Novagen的编号为pET-41，-42，或-49的载体的蛋白），能够用GST树脂非常方便地得到干净一致的纯化蛋白。采用10mM还原型谷胱甘肽的温和洗脱，也使目的蛋白的活性受到了很好的保护。GSTBind树脂采用11个原子的间隔臂（约16 ），通过硫键共价结合还原型谷胱甘肽。这种特别设计的树脂使纯化效率得到提高，因此Novagen的GST树脂载量达到每ml树脂结合载量为58mg目的蛋白。GSTBind 缓冲液试剂盒GSTBind缓冲液试剂盒包括了从GSTBind树脂和GSTMag磁性琼脂糖树脂纯化目的蛋白所需的结合，冲洗和洗脱所需的缓冲液。试剂盒所含成分足够用于10个2.5ml柱的纯化。具体包括： 2100ml 10GST Bind/Wash Buffer （43mM Na2HPO4，14.7mM KH2PO4，1.37M NaCl，27mMKCl，pH7.3） 40ml 10Glutathione Reconstitution Buffer (500mM Tris-HCl，pH8.0) 1g Glutathione，Reduced，Free AcidBugBuster GSTBind纯化试剂盒BugBuster GSTBind纯化试剂盒提供了抽提细胞可溶蛋白和纯化GSTTag融合蛋白所需的各种试剂，包括GSTBind树脂，GSTBind缓冲液试剂盒，Benzonase核酸酶和BugBuster蛋白抽提试剂，使用方便。BugBuster温和破坏大肠杆菌细胞壁释放可溶蛋白，是比弗式压榨法或超声波法等机械处理方法更好的选择，简单、快速且成本低廉。这种非离子配方的去污剂混合物能非常高效地抽提蛋白并保证可溶蛋白不变性。注意：BugBuster是以Tris-HCl-based缓冲液提供，如果需要使用别的缓冲体系，Novagen提供的BugBuster无伯胺型（为PIPPS缓冲）或10BugBuster（无缓冲液）形式都是很好的选择。BugBuster GSTBind纯化试剂盒包括： 2100ml BugBuster蛋白抽提试剂 10,000U Benzonase核酸酶，纯度90% 10ml GSTBind树脂，以20ml 50% v/v悬浊液形式提供 4个色谱柱 GSTBind缓冲液试剂盒（即：100ml 10GST Bind/Wash Buffer，40ml 10GlutathioneReconstitution Buffer，1g Glutathione，Reduced，Free Acid）储存要求4存放的包括：10X GST Bind/Wash Buffer；10X Glutathione Reconstitution Buffer；Glutathione，Reduced，Free Acid；GSTBind树脂（树脂千万不能冻）要求-20存放的包括：Benzonase核酸酶常温存放的包括：BugBuster，色谱柱默克生命科学服务热线：400 820 8872注意：BugBuster在4以下存放时会有去污剂成分析出，在室温下温和摇晃即可重溶，试剂功能不受影响。总述本操作说明用于从大肠杆菌制备的蛋白抽提物（机械法破碎或BugBuster蛋白抽提试剂制备）、用GSTBind树脂进行带GSTTag的目的蛋白的纯化。目的蛋白所带的必须是具有正确折叠的220个氨基酸的GST（GSTTag序列）sequence)，能够与固定化的还原型谷胱甘肽互作因而被亲和纯化。关于克隆表达、诱导发酵的详细介绍请参考“pET系统操作手册”。细胞抽提物的制备操作前的考虑BugBuster蛋白抽提试剂，以及Benzonase核酸酶、rLysozyme溶菌酶等能极大地方便可溶蛋白及包涵体的制备，从而完全替代机械法操作，尽可能地保全蛋白。BugBuster，Benzonase核酸酶，rLysozyme溶菌酶及GSTBind系统均可与蛋白酶抑制剂兼容。GSTBind纯化系统可以与2-巯基乙醇，二硫苏糖醇以及EDTA等兼容。本手册中的操作均可按实际表达水平和目的蛋白的量适当加以调整，特别是关于“柱层析”部分中的GSTBind树脂用量的建议。蛋白酶抑制剂加入蛋白酶抑制剂可以防止蛋白酶水解。可以选用各种蛋白酶抑制剂或其混合物（cocktail），详见Calbiochem目录。无活性GST没有活性的GST是不会与GSTBind树脂结合的。只有正确折叠的功能性GST才能用于纯化。如果目的蛋白的GST没有活性就不能用谷胱甘肽亲和纯化法纯化。因此GSTTag融合的包涵体蛋白必须在纯化前进行重折叠。建议采用Novagen的蛋白重折叠试剂盒（货号70123-3）。用这种快速有效的方法得到的重折叠蛋白中的GST也不是全部为活性GST，可以用GSTTag分析试剂盒（货号70532-3）定量任何样品中功能性GST的量，从而计算理论目的蛋白产量。如果融合表达蛋白中也有HisTag，则可以用HisBind试剂盒进行变性条件纯化。BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法BugBuster Master Mix（货号71456）是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme溶菌酶溶液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预混形式的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100ml和500ml包装分别足够用于20g和100g细胞沉淀的可溶蛋白抽提。可溶蛋白制备采用此操作抽提到的蛋白包括来自细胞周质和细胞质的可溶蛋白。如果欲仅收集周质部分蛋白，可以参考Novagen的TB055“PET系统操作手册”中提到的渗压休克方法或其它合适的方法。渗透休克方法中得到的沉淀也可以用于以下操作以获得细胞质中的可溶蛋白。1. 用经预先称重的离心管10,000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1.5ml或更少），可以用1.5ml离心管14,00016,000g离心。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。2. 室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5ml抽提试剂。这相当于50ml培养液采用2.5ml抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀（例如，1.5ml培养液采用300l抽提试剂）。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。选做：加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号69671），Xa因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。尽管纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。3. 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10-20分钟。注意：孵育后获得的抽提物不是粘稠的。4. 4下16,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明）的材料。默克生命科学服务热线：400 820 88725. 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂（以及其它很多类似纯化系统）。蛋白溶液在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20长时间存放直至下步分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋白经冻融会失活。机械破碎法可溶组分这部分操作用于分离大肠杆菌可溶组分中的蛋白。用去离子水稀释试剂盒中的10浓缩液制备1X GSTBind/Wash Buffer。1. 10,000g离心5分钟收集细胞。倾去上清，尽量控干细胞沉淀。每100ml培养液的细胞用4ml冰冷的1XGST Bind/Wash Buffer重悬。可以加入终浓度为0.1%的NP-40或其它非离子去污剂以减少非特异性结合。可以用Dounce匀浆器，搅拌器或超声波仪打散细胞沉淀。2. 在冰浴或盐冰浴中超声波处理样本。根据厂家说明操作，避免长时间超声处理。如果样本已经不再粘稠即可停止超声。如果DNA没有剪切好会因样品粘稠而堵住柱子。大的细胞块可以在1GSTBind/Wash buffer中用弗氏压榨法处理。或者：在细胞糊中加入终浓度为4560KU/g细胞糊的溶菌酶溶液，吸打混合。30孵育15分钟。再进行超声。将裂解液10,000g离心20分钟。用0.45um膜（滤器）过滤上清。包涵体的纯化除了细胞质中的可溶目的蛋白以外，包涵体中也有大量目的蛋白。经包涵体纯化去杂质、包涵体溶解，包涵体中的目的蛋白重折叠后可以用于GSTBind纯化。1. 10,000g离心5分钟收集细胞。倾去上清，尽量控干细胞沉淀。用40ml 1GST Bind/Wash Buffer重悬细胞。2. 像前述“可溶组分”操作步骤2中那样超声处理，将沉淀充分重悬并切割DNA。3. 5,000g离心15分钟收集包涵体和细胞碎片。4. 去除上清，每100ml培养液以20ml 1GST Bind/Wash Buffer重悬沉淀。重复步骤3操作。或许需要超声处理才能重悬沉淀。但要注意，多次重复这个步骤会释放出更多结合的污染蛋白。注意：为了提高纯度，步骤4的1GST Bind/Wash Buffer中可加入rLysozyme溶菌酶溶液（终浓度为1KU/ml）。短时涡旋，孵育510分钟再离心。5. 溶解洗涤后的包涵体，重折叠后用于谷胱甘肽亲和纯化。GSTBind树脂层析纯化为了获得好的纯化结果，建议采用载量超出抽提样本中目的蛋白约10-20%的GSTBind树脂。Novagen提供的GSTBind树脂的载量是58mg/ml。而以pET系统每100ml发酵液中目的蛋白的产量约为20mg。当然每一种目的蛋白的实际产量会因为基因序列，载体结构，宿主菌品种以及生长、诱导条件等因素的影响而差异很大。SDS-PAGE或Western blotting可以用于粗提物中的目的蛋白粗定量分析。如果目的蛋白含有STag，用Novagen提供的STag快速分析试剂盒（货号69212-3）和FRETWorks STag分析试剂盒 （货号70724-3）可以实现准确定量。如果目的蛋白带有GSTTag则可以用GSTTag分析试剂盒（货号70532-3）获得粗提物中GST的准确数据。默克生命科学服务热线：400 820 8872缓冲液的制备1. 用去离子水稀释试剂盒中提供的10GST Bind/Wash Buffer至1。柱层析约需要15倍体积GST Bind/Wash Buffer，而批次纯化约需要26倍体积。1倍体积是指柱床体积（如100l树脂浆的柱床体积为50l）。2. 制备含有100mM还原型谷胱甘肽的10GST Elution Buffer是将1g还原型谷胱甘肽溶于32.5ml 10Glutathione Reconstitution Buffer。10GST Elution Buffer制备好后应该以操作需要量分装存放于-20，以免谷胱甘肽被氧化。10X GST Elution Buffer在20下可以稳定6个月，耐受5次以下的冻融。每次使用前用去离子水将10GST Elution Buffer稀释成1X。柱层析和批次纯化约需要3倍体积1GSTElution Buffer。注意：1GST Elution Buffer每次必须在使用前新鲜制备，以免谷胱甘肽氧化。柱层析纯化及纯化前树脂在缓冲液中平衡都是室温条件下进行。GSTBind树脂可以用于柱层析（如下）及批次操作（下一节）。1. 轻柔、充分翻转摇匀树脂悬浊液。用宽嘴吸头吸取所需体积的树脂浆（其中树脂为50%）。为了避免出现气泡，往柱子中添加树脂时将吸头尖端始终置于柱子液面以下。等待树脂沉降。小型聚丙烯色谱管（货号69673）可以加载2.5ml树脂（柱床体积），用于纯化1220mg目的蛋白。2. 当储存缓冲液（20%乙醇）液面降到柱床上沿以下时，用5倍体积1GST Bind/Wash Buffer洗树脂。注意：在上样前将蛋白抽提液置于室温水浴以快速使之升温至室温。3. 待GST Bind/Wash Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液。将流速控制在每小时10倍柱体积为宜。如果流速过快，洗脱的目的蛋白中会混入较多的杂质。收集穿过组分并置于冰上。4. 以10倍体积1GST Bind/Wash Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上。5. 以3倍体积1GST Elution Buffer洗脱目的蛋白。收集洗脱组分置于冰上待后续分析。6. 分析洗脱和穿过组分中出现的目的蛋白。若目的蛋白带的是无功能的GST则无法与树脂结合、纯化。小规模纯化批次纯化方法机械裂解法或BugBuster抽提1.5ml离心管可以装50l-200l树脂，更大体积的纯化可以选用15ml或50ml无菌离心管。每次操作包括淋洗，加缓冲液，翻转数次混匀以及4001000g离心15分钟。1. 轻柔、充分摇匀树脂悬浊液。用宽嘴吸头吸取所需体积的树脂浆（其中树脂为50%）。2. 采用上述要求的离心获得树脂沉淀。小心取走上清并丢弃。加5倍体积1X GST Bind/Wash Buffer，翻转混匀并如前述离心。3. 丢弃上清，加入1倍体积1GST Bind/Wash Buffer翻转混匀，重悬树脂（现在50%体积为树脂）。4. 加入蛋白样本，室温下轻柔搅拌孵育30分钟。5. 如前述离心，将含未结合蛋白的上清移入另一离心管，冰上保存。用10倍体积1GST Bind/WashBuffer重悬树脂，离心，移走上清。将淋洗所得上清置于冰上；总共进行两次淋洗操作。6. 洗脱结合于树脂上的蛋白时，加入1倍体积1GST Elution Buffer，室温轻柔搅拌10分钟。离心后将含有目的蛋白的上清移入另一个离心管。再重复两次洗脱操作，可以将所有上清合并。7. 分析洗脱组分和步骤5所获得的组分中出现的目的蛋白。如果目的蛋白所带的是无功能的GST则无法与树脂结合并纯化。默克生命科学服务热线：400 820 8872树脂的再生与储存GSTBind树脂可以重复使用数次而无需再生。但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往会造成流速和结合载量都下降。为了去除结合在树脂上的蛋白，可以用10倍体积的50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0洗树脂，接着用10倍体积的100mM醋酸钠pH4.5，0.5M NaCl再洗一次。其它可以用做去除污染蛋白的缓冲液还包括：6M尿素，6M盐酸胍或低极性溶剂，如5070%乙醇或50%乙二醇。任何上述处理后应立即用10倍柱体积1GST Bind/Wash Buffer平衡。树脂可以在4，20%乙醇/80%水中长时间存放。洗脱后的蛋白处理从GSTBind树脂上洗脱下来的纯化蛋白根据下游应用要求可以进行浓缩或改换缓冲体系。Novagen的D-Tube透析管是一种非常方便的小工具，可以在一种管子中完成透析和浓缩，并有多种加样体积与分子量的规格供选择（可索取说明书）。需要根据特定蛋白的情况摸索储存条件和缓冲体系，以防在长期存放时降解或聚集。相关配套产品GST单抗（货号71097）GST纯化磁性树脂（货号71084）GST重组蛋白定量检测试剂盒（货号70532）蛋白重折叠试剂盒（货号70123）色谱柱（货号69673）BCA蛋白定量试剂盒（货号71285）肠激酶、凝血酶、Xa因子切割试剂盒（货号69022，69036，69671等）D-tube透析/电洗脱管和电洗脱配套试剂盒（货号71511等）默克生命科学服务热线：400 820 8872常见问题及改进建议现象与树脂不结可能的原因目的蛋白中没有GSTTag序列建议测序确认，调整阅读框以获得GSTTag融合表达蛋白合或结合效率低GST融合蛋白被超声打断降解结合条件不对GSTBind树脂使用次数太多使用蛋白酶缺陷型大肠杆菌作为表达宿主菌使用蛋白酶抑制剂如果有稀有密码子应采用Rosetta系列宿主菌过度超声会破坏带标签的蛋白而减少其与树脂的结合。采用温和的超声条件或改用BugBuster蛋白抽提试剂仔细核对各种溶液、缓冲液的成分和pH。低于pH6.5或高于pH8时，融合蛋白与GSTBind树脂会结合不充分。确保树脂在