PCR反应体系与反应条件.doc

PCR反应体系与反应条件聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。编辑本段PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。编辑本段PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)编辑本段PCR步骤标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60-65间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。编辑本段PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。编辑本段PCR反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 PCR的循环参数1、预变性（Initial denaturation）模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95加热3-5分钟。2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、引物延伸引物延伸一般在72进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中的变性步骤循环中一般95，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72维持5-15分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。（四）PCR中的污染和假阳性PCR中污染主要来自1、样品间交叉污染；2、先前PCR产物遗留（carry-over）编辑本段PCR仪器pcr仪器的发展pcr温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。自perkin elmer cetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备，现将部分国内外pcr扩增仪列表如下（表22-5）；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式pcr，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节 省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。国内外生产的几种dna扩增仪1109型北京新技术所与军科院联合机械臂变温水浴电子调温400.5ml16400元/台90a/b型中科院遗传所机械臂变温水浴电热14000元/台ptc-51a/b型军事医学科学院变温气流电子调兼作套式300.5ml12000元/台dna thermal cyclerperkin elmercetus(美)变温铝块压缩机致冷480.5mlus $ 20000.-thermocycler6000180b.braunbiotech(德)变温水浴98四档电热,自来水冷却601.5ml1001.5ml1801.5mldm 30000.-automatic temperature cy-cler single block twin blockericomp inc.(美)变温铝块25100电热,自来水冷却291.5ml581.5mlus $4985.-us $7980.-grant autogengrant instrumant ltd(美)变温水浴099电热,自来水冷却或加冷循环器501.5mlor501.5mlus $250. plusus $ 15.-forrack(x2)techne phc-1phc-2techne ltd.(英)变温铝块099三档电热500w水冷100w540.5ml540.5ml241.5ml3383. 3997. -bioovenbiothrm corp(美)变温气流-150115v 11a200s of 496plateus $ 2990. -trio-thermo-block tb-1biomertra(德) 半导体变温220v320管分别控温dm12900. -micro cycler eeppendorf(美) 变温铝块220v/100v329管us $ 3500. -PCR常见问题PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4过夜。2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4过夜。B）插入片段带有污染，使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3-T缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90时， DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。应用16SrDNA检测致病菌的研究进展发布时间06年02月05日 13时37分黄正根 刘昕如何实现致病菌的快速有效检测，是长期困扰临床的问题，有的细菌极难培养，如嗜肺军团菌，有的细菌生长缓慢，如结核分枝杆菌，还有麻风杆菌、炭疽杆菌等少数无法培养或者致病力很强的菌种。常见细菌用传统培养方法的检测时间大约为35d，临床亟待更加快速准确的检测方法。基于聚合酶链反应（PCR）扩增的基因诊断技术备受青睐，尤其是基于细菌核糖体16S小亚基（16SrDNA）的基因（16SrDNA）的分类鉴定引起了广大的科研工作者的重视。一、关于16SrDAN16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因。长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关1-3，Trand等通过对27株原核生物16SrDNA的比对发现其中至少在9个高度保守的寡聚体（oligomers）；较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称2，4。Woese等3与Olsen等4基于对16SrDNA的分析构建了现已被分认的全生命系统进化树，越来越多的细菌依据16SrDNA被正确分类或重分类，尤其是许多环境中的细菌5。6，如Funke等将棒杆菌依赖细胞毒性1组及类似棒杆菌重新确定为放线菌的一个新种，即钮氏放线菌中，Bennasar等通过比较14株施氏假单胞菌的7基因型（DNA-DNA杂交同源组），发现SP1402T（T为模式株）和SL401与施氏假单胞菌模式株明显不同，从而命名为一个新种称巴利阿里假单胞菌（Pseudomonas balearica）2；有的研究者还根据种内菌株间的RFLP而将各菌分为不同的核酸型（ribotype，RT）7。关于16SrDNA的数据库信息及分析软件较其它分类鉴定用的基因丰富得多，如RDP（http：//html/）、ARB(http:/www.ard-home.de/)、ORS(http:/soul.mikro.biologie.tu-muenchen.de/ORS/)、OPD(/OPD/)及PRIMROSE、CLUSTAL-X、PRIMER PREMIER、DNA START等，各分析软件因采用的算法（algorithm）不同而各有所长。二、16SrDNA与致病菌的检测16SrDNA的保守性使应用单一方法进行细菌的统一检测成为可能，基因诊断的灵敏度高、快速准确。尤其在苛养菌及生长缓慢的菌种的检测中具有十分明显的优势。1常规PCR检测方法：Cunha等8用PCR方法检测HIV-I携带者尿道拭子中的支原体，与常规培养和血清学试验作比较，认为PCR的检出率高且耗时少；Gorkiewicz等9通过以弯曲杆菌16SrDNA的测序结果分析，发现16SrDNA甚至可以精确地鉴定到这种水平；Yeung等10对商用益生菌的微物态分析也证实了这一点；Nimri利用PCR方法成功检测出临床的布鲁菌感染11，比血清学方法简便、快捷。Hugenholtz等12通过对16SrDNA的荧光原位杂交（fluorescense in situ hybridization，FISH）探针的优化设计及杂交条件的调整，认为特异性探针在适宜的杂交条件下作为病原全的检测手段是可行的； Wilck等13利用PCR联合测序技术成功检测出石蜡包埋的心内瓣膜赘生物国的细菌，该菌在石蜡中即可通过染色镜下检出，但是血培养却始终是阴性；Satuta等15基于消化性链球菌属的16SrDNA差异设计特异性引物进行多重PCR，经过两步多重PCR（two-step muptiplex PCR）能快速准确地鉴别常见的14个种；Sacchi等16应用巢式PCR对美国炭疽事件中的疑似病人的标本进行测序分析。证明PCR测序的快速鉴定炭疽杆菌并与其它芽孢杆菌相鉴别有效方法；李聪智等17设计了针对所有细菌的通用引物和针对革兰阴性及革兰阴性或革兰阳性的鉴别；其它技术如PCR-斑点杂交、PCR-反相杂交、PCR-ELISA、PCR-SSCP等应用于结核分枝杆菌各型的鉴定及临床新生儿败血症和化脓性脑膜炎的诊断18-24。216SrDNA基因芯片与致病菌检测：利用16SrDNA恒定区的保守性设计通用引物，扩增全长或者部分16SrDNA序列，在可变区设计检测探针（杂交探针），用一对或几对引物就能将几乎所有细菌的相应片段扩增出来。再与固定在芯片基质上的特异性探针杂交，可以定性或者半定性检出致病菌。16SrDNA联合rpoB、kasA、rpsL、gyrA等制成的基因芯片已经成功地应用于分枝杆菌的筛选鉴定及结核杆菌的耐药性筛选和分析25-27；李君文等28应用16SrDNA于4h内可以快速检测出饮用水中嗜肺军团菌、副溶血弧菌、李斯特菌、耶尔森菌、变形杆菌、绿脓假单胞菌等常见致病菌；中国军事医学科学院29建立了检测临床20种常见细菌的16SrDNA基因芯片模型，比较了16SrDNA克隆探针与寡核苷酸探针的杂交效率，将PCR扩增产物（907bp片段）分别与上述两种探针（荧光染料Cy5标记）杂交，结果显示：16SrDNA克隆探针具有广泛和灵敏的特点，但是交叉反应明显，寡核苷酸探针特异性强，但灵敏性稍差；Wilson等30应用高密度的16SrDNA芯片准确鉴定出常见17种致病菌中的15种（包括变通拟杆菌、艰难梭菌、蜂房哈夫尼菌、苏云金芽孢杆菌、唾液链球菌及肺炎支原体、立克次体等）；Peplies等31以大肠埃希菌（E.coli）的16SrDNA为靶序列探讨了芯片寡核苷酸探针设计有关问题及杂交条件的优化，引入了未标记的“helper”寡核苷酸观察控针二级结构对杂交的影响，同时证实了克服空间位阻的锚定链（poly ATP）的最佳长度因探针而异，探针方向对杂交效率无明显影响；Urakawa等32为了鉴别16SrDNA芯片杂交的单碱基错配信号，引入“DI”（discrmination index）指标及“NN”（neural network analyses）分析方法，结合优化杂交条件来鉴别单碱基错配（假阴性）。Chandler等33构建成成一个能有效克服二级、三级结构影响的双探针体系（two-probe proximal chaperone detection system），这个体系由种特异性的捕获探针（capture probe）及与之相邻的带标记的伴护探针（labeled proximal chaperone probe）组成。前者固定在芯片基层上，可以直接捕获细菌的16SrRNA（intact rRNA），后者（生物素标记）结合在与之相邻的特异性序列上，这对探针在靶序列上相距约10个碱基的空位（spacer）；该体系既能有效地防止空间结构（base-stacking：碱基堆积）对杂交的影响，还能显著提高单碱基错配的鉴别能力。Busti等34设计了种特异性的连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）探针（引物），其中每一对探针由鉴别寡核酸（discrimmatimg oligo）和通用探针（common probe）组成。前者的5端用荧光染料Cy3，后者的3端连接有cZipCode（complementary ZipCode）；通用芯片（universal chip）上固定了与cZipCode互补的Zip探针，当检测到特定的细菌16SrDNA时，LDR的两探针在pfu DNA ligasa作用下连接成一条寡核苷酸探针，其5标记有Cy3，3端为cZipCode，则3端再与通用芯片上相应的Zip探针杂交就能在待定位置检测到Cy3的信号，该方法能有效地分辨各菌种间16SrDAN单个碱基的差别，不足之处是仅能检出LDR探针相应的菌种。为了扩大芯处至致病菌的检测谱，Bertilsson等35设计出一种从未知（16SrDAN）的菌种中合成特异性探针的方法。该方法针对或变区（序列未知）两侧的恒定区（各菌种相同）设计一对通用引物，其中一条引物称为可分离的引（detachableprimer），其5末端标记上生物素，3末端为一个核糖苷（ribonucleotide）；PCR扩增产物与链亲合素包被的磁珠（streptavidin-coated magnetic beads）结合后在85高温下洗脱除去一条互补链，再通过碱性水解将剩余片段与磁珠分离；再以上述洗脱下来的片段为模板，合成另一条可分离的引物对它进行每二次PCR扩增（线性扩增）；第二次PCR扩增的产物再经过上述磁珠结合，水解分离先进步骤，即可得到特异性的探针，此探针的特异性取决于该可变区（PCR扩增区）的变异程度。三、问题与展望16SrDAN检测致病菌虽然有快速、直接、准确等优点，但是它有一个无法克服的问题：只要有细菌的DNA碎片（死菌），检测结果就是阳性18，不能区别是感染状态还是恢复期；以序列比对为基础建立起来的16SrDAN基因诊断，要想成为一种临床检测的常规方法，还需要一个强大的质控序列数据库36，37 ；而且肖的数据库还不够完善，甚至数据库的有些信息是错误的1；想在短短的一个或者两上可变区内（近百个碱基）找到足够多的差异信息几乎是不可能的30；同时，芯片杂交的重现性仍待解决，严格质量控制下的实验研究的结果与临床的广泛应用还有一定的距离；尤其是要在检测的细菌谱比较广的前提下，达到所有属间甚至种间的鉴别，以及对混合病原全（多重感染情况下）的鉴定。总的说来，16SrDAN的鉴别能力在属及属以上分类单位38，近年的研究发现，16SrDAN与23SrDAN的间区序列（intergenic spacer，ITS或internal transcribed spacer，ITS或intergenic spacer regions，ISR）39-41也可以用来对细菌进行分类和鉴定，但是依据23SrDAN绘制出来的系统发育树与16SrDAN的有一定出入，而且在少数菌中16SrDAN还存在的插入突变42；因此，将二者结合起来进行细菌的分类和鉴定可能是以后临床诊断研究的方向。如果充分利用芯片的高能量特性，结合16SrDAN-32SrDAN间区序列的相关特性43，设计3-5个探针指向同一种细菌。将近全长甚至超全长16SrDAN的PCR扩增产物片段化后杂交，优化杂交条件，同时联合十几种临床常见耐药基因的检测。那么，16SrDAN基因芯片用于临床感染病的快速诊断及指导性用药是完全可能实现的。摘自：中华检验医学杂志2005年6月28卷第6期走近生物芯片技术访中国军事医学科学院放射医学研究所马立人教授随着人类基因组（测序）计划（Human genome project）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法对大量遗传信息进行高效、快速的检测和分析就显得格外重要了。生物芯片技术的兴起大大加速了基因序列的破译，揭开了生物体中巨大遗传语言之谜，揭示了生命本质，生物芯片技术是20世纪末21世纪初生物技术领域迅速升起的一颗的明珠，它的光芒渗透到生命科学的各个领域。那么，该项技术是如何发展的，目前的状况、发展趋势以及与之密切相关的生命科学仪器的发展又是怎样的状况呢？带着这些问题，近日，本网（以下简称：instrument）专程走访了药物分析学学科带头人，军事医学科学院放射医学研究所马立人教授（以下简称：马）。Instrument：马教授，您好！我们知道您从事了多年的生物芯片方面的工作，编写了国内第一本系统介绍生物芯片技术的书生物芯片，那您先给生物芯片下个定义，好吗？马：生物芯片的概念来自于计算机芯片，发展至今不过10年左右。最初的芯片技术主要目标是DNA序列的测定，基因表达谱鉴定和基因突变体的检测和分析，所以它又被称为DNA芯片或基因芯片。但目前这一技术已经扩展到免疫反应、受体结合等非核酸领域，以至在阐明疑难杂症机理中都起到了重要作用，所以按现状改称为生物芯片更符合发展趋势。芯片分析的实质是在面积不大的基片表面上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子。结合或反应在相同条件下进行。反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息。芯片分析实际上也是传感器分析的组合，芯片点阵中的每一个单元微点都是传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被应用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性。所以芯片技术也是传感器技术的发展。Instrument：生物芯片技术的发展过程是怎样的呢？主要应用在哪些领域？马：基因表达分析恐怕是生物芯片应用最多的一个方面，细菌、霉菌、植物、哺乳动物等都进行过科学研究。我们知道原计划于2005年才能完成的人类基因计划，由于DNA测序技术和测序效率的迅速提高，于2001年12月就宣布完成框架图和初步分析结果。在阐明人类基因组核酸全序列的前后几年中，有近百种动物、植物及微生物的基因全序列也已经定出。但这些基因序列中，其生物学意义多数是不清楚的。不少公司根据阐明的序列制作基因芯片供应市场，希望通过表达分析来了解其生物意义，但很快就认识到基因仅仅是遗传信息的载体，而生命活动的执行是基因的表达产物-蛋白质，因此蛋白质组计划及蛋白芯片就提高到重要的位置；随着生物芯片技术在病理组织和组织化学方面的应用，又出现了组织芯片，不同的组织做成不同的芯片，比如大脑、前列腺、肝脏等，用于蛋白表达研究、抗体筛选、组织型特异研究及小鼠模式实验研究等；另外，还有一些新原理的生物芯片，如微流路芯片、细胞芯片、多肽芯片、质谱芯片、电芯片等随着生物芯片技术的发展也快速发展起来。杂交测序是发展DNA芯片技术的初衷，但由于众多的核苷酸的组成各不相同，各有自己的最佳杂交条件，这就使得每一对双链杂合子都是最佳，这样一种条件很难找到，其结果是出现一定数目的假阴性和假阳性杂交结果，引起误导，加之芯片技术自动化程度和成熟程度等方面还有不足，因而生物芯片技术在核酸测序技术中，未能被选为法定方法，真正建功立业的主要技术却是多通道毛细管电泳。但生物芯片技术也有自己的优点，高通量、平行对比分析，可以获取其他方法无法取得的资料，因此它仍是一项先进的高通量分析手段。近年来，已经证明基因芯片的最佳应用领域是单核苷酸变异多态性的研究、差异表达分析的研究及改变模式，尽量向临床诊断和临床研究靠拢及开拓其他领域的应用。从经济效益来讲，最大的应用领域是制药厂用来开发新药，目的是在基因水平上寻找药物靶标以及查找药物的毒性和副作用，进行独立学研究；在农业和林业上，生物芯片技术也有广阔的应用天地，应用芯片于基因测序将大大加快DNA多肽性的鉴定，从而促进动植物育种和植物新品种的产生；在医学上，芯片研究也广泛被应用于遗传病、肿瘤、炎症等方面的研究。可以说生物芯片的应用目前已经遍及生物、医学研究的各个领域。Instrument：那您所从事的生物芯片技术和您前面讲的一样吗？马：我选择的方向和前面说的这些不太一样。前面讲的这些基因芯片是用在基因序列测定，基因组的研究，用的是高密度芯片，要几千个点，几万个点，价格都很昂贵，目前国外已经有很多基因芯片厂商，做的都是高密度芯片，我们不想往这个方向努力，想做一些实际有用的东西应用在临床诊断上。比如引起腹泻、呼吸道传染病的细菌或病毒，用高密度芯片来检测，成本非常昂贵，不是普通人可以接受的，而且也是一种浪费。因此我们想是否可以做一种低密度芯片（100个点以下），既能很好地检测细菌或病毒，指导诊断和治疗又经济实惠呢？实验表明：是完全可以的，而且这种低密度芯片我们已经做好了，并申请了国家专利。Instrument：请您详细介绍一下低密度生物芯片？都可以用于哪些病的诊断呢？马：我们做的这个