酵母表达系统表达外源基因的研究进展.doc

酵母表达系统表达外源基因的研究进展第20卷第4期1999年12月7弓一首都师范大学学报(自然科学版)Journal0fCapitalNormalUniversity(NaturalScienceBdition)Vol-20.No.4Dec1999酵母表达系统表达外源基因的研究进展张飞雄立lJ_旦首都师范大学生物系)(空军总医院分子生物学研究中心)摘要/7阐述了几种常用的酵母表达系统的研究现状及应用前景,井对酵母分泌的外源蛋白的含量及糖基化程度进行了比较.我们认为:甲醇营养型酵母分泌的外源蛋白量高且无过度糖基化现象,具有良好的应用前景关键词:酵母表达系统,外源蛋白,糖基化程度,甲醇营养型酵母中图分类号:Q936外塬釉酵母菌是一类单细胞真核生物人类对酵母菌的应用,尤其是酿酒酵母,具有几千年的悠久历史.积累了大量的生物学和遗传学方面的资料.鉴于酵母菌生长旺盛和其独有的一些特性.它已被发展成为表达外源基因的重组表达系统酵母作为单细胞生物一方面在操作和生产上具有细菌表达系统的特点;另一方面又具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰过程.如,二硫键的正确形成;前体蛋白的水解加工;糖基化作用等.利用酵母表达系统表达外源蛋白的宿主包括:酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae);乳酸克鲁维亚酵母(Kluyveromyceslactl);粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe);烷烃利用型耶鲁酵母(Yarrowili加lytica);西方许旺氏酵母(Schzvanuiomyceseccidentalis);多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和巴氏毕赤酵母(Pichiastoris)本文旨在对酵母表达系统的研究现状及应用前景做一综述.1几种常用的酵母表达宿主及载体1.1酿酒酵母酿酒酵母(s.cerevisiae)很早就被应用于食品和饮料工业,也是人们最先建立的酵母表达系统.自1981年Hitzeman等首次报道了人重组干扰素基因在酿酒酵母中表达成功后.相继又有多种外源基因在该表达系统中表达成功_2】.目前已发展和建立了几种该表达系统的表达载体,但以整合体型(YIptype)载体和附加体(Yep-type)载体最为重要.整合型载体不舍自主复制序列(ARS),而是被整合到酵母宿主菌的染色体上,这类载体的优点是稳定性好,但它的缺点是拷贝数低附加体型载体,由于含有来自酵母天然质粒2复制起点序列,能够独立于酵母染色体外自主复制,拷贝数通常可达30拷贝以上,但在非选择条件下多不稳定.发酵收祷13期:1998.10-2774首都师范大学学报(自然科学叛)1999正生产过程中质粒丢失仍是问题j.1.2克鲁维亚酵母乳酸克鲁维亚酵母(K.ctis)被作为工业化生产人用蛋白的安全微生物.利用乳酸克鲁维亚酵母进行大规模工业化生产时有其独特的优点:(1)可以高密度发酵;(2)不需要甲醇防爆装置;(3)工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再繁殖能力.乳酸克鲁维亚酵母可以利用乳糖作为唯一的能源和碳源由乳酸克鲁维亚酵母LAC4基因编码的半乳糖苷酶可使乳糖分解代谢.因此,在含有乳糖的培养基上生长时乳糖利用途径的酶类能够被强烈诱导J.现已分离得到了LAC4启动子,外源基因就可以在它的调控下表达.乳酸克鲁维亚酵母的表达载体也是通过附加体型载体和整合体型载体来表达外源基因.附加体型载体有三种:(1)胞质线性双股DNA杀伤质粒;(2)含有乳酸克鲁维亚酵母ARS序列(称KARS);(3)稳定高拷贝数2样pKD1和pKWl质粒第一种质粒对外源蛋白的表达有限,因为胞质线性双股DNA杀伤质粒pGKL1和pGKL2均是线性的,在其5端含有共价结合的蛋白,因此在体外和大肠杆菌中操作复杂.限制了其作为表达外源蛋白载体的作用.KARS质粒的主要问题是有丝分裂的不稳定性.pKD1是一种环形质粒,可在乳酸克鲁维亚酵母中复制.并有稳定的高拷贝数(70100/每个细胞)其功能性结构与酿酒酵母的2质粒非常相似,甚至有一些相同的序列】.Fke.等用pKD1载体成功地表达了人血清白蛋白和白细胞介素lB但是人们也发现pKD1类载体是菌种依赖性的,并且受启动子和培养条件的影响很大.对于整合体型载体而言,表达盒被整合到克鲁维亚酵母基因组中的LACA位点或核糖体DNA重复序列中.这种整合方式不仅可以提高外源基因的稳定性.还可以提高被整合基因的拷贝数.1.3甲醇营养型酵母甲醇营养型酵:(Methylotrophicyeast)包括:巴氏毕赤酵母(P.pastoris)和多形汉逊酵母(H.Pol2znorpha).1.3.1巴氏毕赤酵母是最近迅速发展起来的一种表达宿主_9它以甲醇作为唯一的能源和碳源,可以在含有甲醇的培养基中生长.甲醇能够迅速诱导巴氏毕赤酵母合成大量的乙醇氧化酶(Alcoholo)idase,AOX).在巴氏毕赤酵母中有两个基因编码AOX,约占全部可溶性蛋白质的30%以上.AOX1基因严格地受甲醇的诱导和调控,AOX2基因与AOX1基因序列相似,有92%的同源性,其编码蛋白质有97%的同源性I1oj.AOX1基因的编码产物在氧化过程中起主要作用.甲醇能诱导AOX的合成,而甘油和葡萄糖则抑制AOX的产生,只有在去除其它能源后,利用甲醇诱导才能启动AOX1基因的信号转录和翻译.典型的巴氏毕赤酵母表达载体含有乙醇氧化酶基因5AOX1启动子,3AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶(Histidinoldehydrogenase)基因HIS4作为互补筛选标志或Zeocin作为筛选标志.作为一个能在大肠杆菌中繁殖,扩增的穿梭质粒,它还含有pBR322质粒的部分序列和氨苄青霉素(Ampg)抗性基因的筛选标志.表达载体通过同源重组整合到酵母细胞染色体DNA中.重组时用DNA内切酶Bg1lI,DraI和SalI等线性化表达载体,使之整合于酵母基因组内的AOX1基因的位置,整合后的外源基因随酵母的生长可稳定地传代存在.目前,Invitrogene公司已开发出多种巴氏毕赤酵母表达载体.如:pPIC9.pHIL-D2,pHIL-S1,pPICZA,B,C系列和pPICZnA,B,C系列等适合于胞内和分泌的表达载体.应用巴氏毕赤酵母表达系统表达外源基因具有以下优点:(1)其表达载体含有特有的乙醇氧化酶(Aox)基因启动子,通过甲醇诱导AOX1调控外源基因的表达;(2)可以高密度连续发酵培养,外源蛋白表达量高;(3)根第4期郑敏等:酵母表达系统表达外源基因的研究进展75据载体类型,外源基因表达产物既可以在胞内积聚又可以被分泌到培养基中,而分泌的外源蛋白占酵母细胞分泌蛋白的量大,利于工业生产和分离纯化;(4)巴氏毕赤酵母能对所分泌的蛋白进行N一,一糖基化修饰且糖基化程度适中.1.3.2多形设逊酵母是与巴氏毕赤酵母相似的另一甲醇营养型酵母,征培养基中加入甲醇后迅速诱导甲醇代谢途径中的一些酶类产生.而在含葡萄糖的培养基中生长时,这些酶的合成是受抑制的.当用甲醇诱导后,三个关键酶:甲醇氧化酶(Methanoloxidase,MOX)i甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,FMD)和双羟丙酮合成酶(Dihydroxyacetonesynthase,DHAS)可达菌体胞内总蛋白的203O%,若该培养基中含有低于0.3%的甘油情况下,这些酶可达30%以上.目前编码这些关键酶的基因已被克隆_1,并用于调控外源基因的表达.Ge1isseni2等将来自西方许旺氏酵母的葡糖淀粉酶(glucomylase)外源基因,其中包括信号肽克隆到多形汉逊酵母表达载体pFMD-22a的FMD启动子和MOx终止子之间的多克隆位点,在FMD启动子的控制下,外源基因被有效地分泌表达,表达量为1.4g/L.此外,多形汉逊酵母中,外源基因可以通过非同源重组以首尾相接排列,整合到多形汉逊酵母染色体DNA中形成多拷贝基因的重组菌_1.与巴氏毕赤酵母相比,多形汉逊酵母对外源基因的表达可以受强启动子FMD和MOX的调控,而且在含甘油的培养基中加入甲醇也可以诱导外源基因的高表达,从而避免了两步发酵工艺.多形汉逊酵母表达载体的信号肽序列一是来自外源基因自身的信号肽.另一个是来自酿酒酵母的MFa.该信号序列融合到KFX2识别位点.在蛋白分泌过程中,KEX2识别该序列并切除信号肽部分【13.2酵母表达载体的结构特点与多拷贝基因用于转化合适酵母宿主细胞的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的”穿梭”质粒.它是由来自酵母的部分基因序列和细菌的部分基因序列所组成.其原核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列.这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖和筛选组分.酵母部分包括酵母转化子的筛选组分,主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如:HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如:抗Zeoein的基因序列),以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列作为一个表达型载体,需要一个强的启动元件,人们根据不同酵母菌的研究已发现了多个可以利用的强启动子.如:酿酒酵母的强启动子PGK1,PHO5,CUP1等i巴氏毕赤酵母启动子AOXI已被克隆用于外源基因的表达i克鲁维亚酵母能利用乳糖,因为它有LACA基因编码B半乳糖苷酶,它的启动子证明是调控型强启动子;多形汉逊酵母的强启动子MOx和FMD启动子也被用于外源基因的表达.分泌型表达载体中带有信号肽序列,其编码信号肽的DNA序列已和表达框架一起构建到载体中.所以,外源蛋白在酵母分秘表达时可以使用异源信号肽或酵母自身信号肽.有研究表明,自身信号肽可能要优于异源信号肽L1.但是外源蛋白在酵母系统中表达对选择一个合适的信号肽是相当复杂的.对于有些蛋白自身信号肽可以引导分泌表达,如:人血清白蛋白(HAS),蔗糖酶和牛溶菌酶,而以M作为异源信号肽在酵母中分泌表达外源蛋白也非常有效,尤其是对较小分子蛋白产物的分泌表达,如:表皮生长因子(EGF),血液因子,单链抗体片段等.酵母表达系统的载体主要分为附加体型载体和整合体型载体两种.如:酿酒酵母表达系统多为附加体型载体,巴氏毕赤酵母,多形汉逊酵母表达系统为整合型载体,克鲁维亚酵母表达76首都师范大学学报(自然科学版)1999正系统则兼而有之附加体型载体在酵母宿主中的拷贝数量大.但是在传代过程中易丢失.影响重组菌的稳定性和表选量.整合体型载体导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组DNA整合,因此稳定性高,但是基因的拷贝数量低.通过整合体型载体上介导的整合序列为基因组中的重复序列,也能获得多拷贝基因的重组子.也可以人工构建串联重复的多拷贝基因,然后再转化酵母宿主细胞.形成多拷贝基因的重组子.3酵母分泌外源蛋白的糖基化比较加到分泌蛋白上的碳水化合物的结构是微生物本身决定的.由酿酒酵母宿主分泌的多数外源蛋白,均是过度糖基化的(>40个甘露糖残基)_l.但是,在甲醇营养型酵母表达系统通常不存在这种情况.巴氏毕赤酵母分泌表选糖蛋白的寡糖链平均长度大约是814个甘露糖残基l1.由此导致不同酵母表达系统分泌糖蛋白的分子量不同.巴氏毕赤酵母分泌表达蔗糖酶的分子量约为8590KD,而由酿酒酵母宿主分泌蔗糖酶的分子量约为100140KD.与酿酒酵母的情况相比,巴氏毕赤酵母和多形汉逊酵母分泌的蔗糖酶并无过度的糖基化.多形汉逊酵母表达系统所分泌的异源西方许旺氏酵母葡萄糖淀粉酶中有N一,o糖基化_l,但无过度糖基化的现象.西方许旺氏酵母分泌的糖蛋白也无过度糖基化现象.来自该酵母的天然糖蛋白仅含蛋白分子量的1015%的N一连接碳水化合物.耶鲁酵母分泌的(tPA)仅含短的寡糖链(810个甘露糖残基).另外,酿酒酵母表达系统和巴氏毕赤酵母分泌表选系统分泌的糖蛋白在寡糖链的结构上有区别,巴氏毕赤酵母分泌的蔗糖酶(糖蛋白)的聚糖末端不含n.1,3连接的甘露糖残基,而这种形式的糖残基恰是酿酒酵母所分泌的糖蛋白末端的特点.这种糖蛋白具有很强的免疫原性.因此,酿酒酵母分泌的外源糖蛋白不适合作为药物治疗使用.4酵母系统表达外源基因的应用和展望自80年代初.Hitzeman等首次应用酿酒酵母表选了人干扰素基因以来,应用酵母这种单细胞真核生物表达外源基因越来越受重视.建成了多种基因表达系统9,”,成功地表达了多种蛋白.尤其近几年,巴氏毕赤酵母,克鲁维亚酵母和多形汉逊酵母由于其自身旺盛的生长能力和独有的一些生物学特性,更为众多的研究者所关注.巴氏毕赤酵母表达系统已被证明是既可以用于分泌表达又可以胞内表达外源基因的一个理想的酵母表达系统.它有强启动子AOX1,完善的分子生物学操作方法,成熟的高密度发酵技术,已成为生产商业化蛋白的重要表达系统之一.利用其强启动子AOX1已经高效表选了多种外源基因,如:肿瘤坏死因子】,破伤风毒素C片段】,蔗糖酶,人血清白蛋白,蛋白酶抑制因子等基因的表达产物都超过每升发酵液1g的水平.其中肿瘤坏死因子和破伤风毒素C片段每升发酵液可高达10g以上.利用克鲁维亚酵母表选系统已成功地表达了牛凝乳酶,人血清白蛋白,L-l和人溶菌酶等外源基因.该菌可以高密度发酵.表达载体有稳定的附加体型载体和整合体型载体.并且表达产物有较好的分泌性等.在工业生产上有很强的应用价值.多形汉逊酵母的表达系统已应用于表达乙型肝炎表面抗原,葡萄糖淀粉酶,内酰胺酶等.但是,其强诱导型启动子MOX1在高密度发酵时易受抑制,影响表选产量,其应用不如巴氏毕赤酵母表达系统.随着现代分子生物学技术的发展.人们将进一步地探索各种酵母表达系统的强启动子元件;分泌信号肽以及对外源蛋白表选,分泌的影响因素有理由推测酵母表选系统在未来的发展和应用中将占有重要的地位.第4期郑敏等:酵母表达系统表达外源基因的研究进展参考文献1HitzemanRA,HzgieFE,LevineHLetatExpresaionofahuITltngeneforinterferoninyeastNature.1981.293:7177222CllLssenG,MelberK,JanowiczzAetatHerrologousgeneexpreioninyeastJGMoleMicrobin1.199la,62:79-933HirmenA,BuxtonF,ChandhruiBeta1.GeneexprmsioninrecombinantyeastInSmithA(Ed)Geneexpreseioninrecombinantorganisms.NewYork:Mal-celDekker,1994,1211934KojoH,GreenbergBD,SnginoA.Yeast2umplsmidDNAreplicationinvitro:o-培_nanddirection.ProcNadAcndscjUSA,1981.78:7261-72655PhHJ.BiokgyofyeastsotherthanSaccharom3res,In:DemainAL.SalomonNA(Eds)BiologyofindttstrialmicroorgnkmBenjaminCummings:MenloPark(CA),1985,537-5626SreekrishnaKWebsterTD.DicksonRCTransformationofKluyveromycesLact/s.withtheKanamycin(G418)ristaneegeneofT咖3Gene,1984;28:73817ChenXJ.SatiolaM,Fatco6eCetat.SequenceorganizationofthecircularPlamuicpKD1theyeastKlu3cesdrarophilarum.NucleicAcidsRes.1986(14):4471-44818FleerR.YehP.AmmdlatNeta1.Stabtemuitieopyv筐torsorhigh-levelsecretiondreccnhinamhuman$1121/TtalbuminhyKluNoerom3resystsBio/TechnokRy.1991a(9):968-9759CreggJM,VedickTS.RasehkeWC.RecentadvancesintheexpresaionofforetgngenesinPichiaPas-托.Bio/Technology,1993(11):905-91010CreggJM,MaddenKR,arzingerKJetatFunctionalcharacterizationofthetwoalcoholoxidssegenefromtheyeastPich缸Pasto.MolCellBio1.1989,9:13161323I1LeboerAM,Eder-sL.VaatJetat.MoleculardomngandcharacterizationofgenecodingformethanoloxidsseinHansenuPotymorpha.NuclcicAeidsRes.1985,13:3063308212GillenG,JancowiczzA,merckelhachAeta1.Heterologousgeneexpressionint-lamulaPolymor0ha:efficientsecretionofgluo3amylaseBio/Technology.1991(9):291-29513BrakeAJ,MerryweatherTP,ColtPGetalQ-Factor-directedsynthesisandsecretionofmaturefo咖proteininS缸nm唧Cerevisiae.ProcNatalAcadSciUSA,1984,81:4642-464614RomanoMA,ScorerCA.ClareJJForeigngeneexpreoninyeast:areview.Yeast,1992,8:42348815TanrinoAL,HummerTH,MaleyFTherelaseofintactoligaccharidesfmmspeciglycoproteinsbyendo-NacethlglucamiindaseHJBiolChem,1974,249:818-82416GrinnaLS,TschoppJF.SizedistributionandgeneralstructuralfeatureofNlinkedoligosaccharidesfromthemethylotrophicyeastPichiaPa雎i.Yeast,1989,5:107-115L7SwinkdsBW.AlbertJJ,VnOyenAJet.TheyeastKmm5Lactisasandiiemhosttotheterolognusgeneexpreion.AmonteVanLeeawenhoek,1993,64:18720118SreekrishnaK,NellesL,PotenzRetat.Highlevelexpresalon,purificationandcharacterizationofreeombJlmnthumannecrosisfactor.synthesizedinthemethylotrophieyeastPichiapastorisBiochemistry.1989(28),4117412519ClareJJ.RomanosMA.RaymentFBetalproductionofm0useepidermalgrowthfactorinyeast:highlevelsecretionusingPichiaPastorisstraincontainingmultiplegenecopies.Gene,1991,105:20521220TschoppJF,SvertowG,KmsonReta1.HighsecretionofglycylatedinvertaseinthemethyIotrophicyeast,P