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现代环境分析技术 余江 环境催化与分离过程研究组北京化工大学化工学院 2013年10月21日 Topic3 1 色谱分析法 色谱概论气相色谱液相色谱离子色谱 Q1如何定性分析复杂体系中各组分的成分及含量 例 5 的乙醇水溶液中的乙醇含量如何测定 例 如何分离和鉴别对二甲苯 甲苯 苯及仲丁醇的混合液 俄国植物学家Tswett于1901年发现 利用吸附原理分离植物色素 一 色谱分析法的历史 二 色谱方法的分类定义 色谱分离技术是借助色谱分离原理而使混合物中各组分分离的技术 将色谱分离技术应用于分析化学 称为色谱分析 色谱法的分类 物理状态分类 流动相的物态 固定相的物态 气相色谱法 GC 液相色谱法 LC 液 液色谱法 气 固色谱法 气 液色谱法 液 固色谱法 使用的形式 柱色谱 纸色谱 薄层色谱 分离机理分类 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 3 色谱法的特点 1 高选择性 2 高效能 3 高灵敏度可以分析质量分数为10 6 10 9数量级 检出限量低至10 1lg的物质 适于微量和痕量分析 4 色谱法的应用 1 色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析 2 液相色谱法 在糖类 氨基酸 农药 染料 贵金属 有机金属化合物等方面得到了广泛的应用 3 色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术 常用于制备分离 得到高纯样品 4 色谱 质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段 Q2如何解析色谱图 即色谱图给我们提供了那些信息 三 色谱常用术语 色谱图各组分的浓度随流出时间而分布的曲线称为色谱曲线 常称为色谱曲线图或色谱图 基线没有试样进入检测器时 记录仪记录的是一条直线 这条直线称为基线 基线是在实验操作条件下 反映检测器系统噪声随时间变化的曲线 色谱峰的高度 宽度 半峰宽度 峰高 h 峰高h指色谱峰最高点到基线的距离 一般用cm为单位 峰宽 Y 与半峰宽 Y1 2 从色谱峰两侧的转折点 拐点 作切线 在基线上的截距叫峰底宽 y 简称峰宽 峰高一半处色谱峰的宽度叫半峰宽 y1 2 由于色谱峰顶呈圆孤形 色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半 保留值 表示被测组分从进样到色谱柱后出现浓度最大值所需要的时间 或所需载气的体积 叫做保留值 保留时间 tR 是指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需的时间 组分在流动相中停留的时间 在固定相中所停留的时间 调整保留时间 tR 组分的保留时间与死时间的差值 tR tR t0它表示与固定相发生作用的组分比载气在色谱柱中多滞留的时间 实际上是组分在固定相中所滞留的时间 保留体积 VR 从进样开始到柱后出现浓度最大值所需要的载气体积VR F0 tR 调整保留体积 VR 指扣除死体积后的保留体积VR t0 F0 死体积 V0 不与固定相作用的组分从进样到柱后出现浓度最大值所需要的载气体积 若载气的体积流速为F0 则死体积为V0 F0 t0 相对保留值 表示组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比 值越大 两组分的色谱峰相距越远 分离得越好 Q3气相和液相色谱仪是如何检测分析目标物的 气相色谱仪 1 气相色谱议的基本部件与作用 气相色谱仪的工作过程气相色谱仪分为 载气系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统共五个主要组成部分 2 气相色谱检测器气相色谱检测器可分为浓度型检测器与质量型检测器 浓度型检测器的响应值和组分的浓度成正比 质量型检测器的响应值和单位时间内进入检测器的质量成正比 常用的浓度型检测器有 热导池检测器 TCD 电子捕获检测器 ECD 常用的质量型检测器有 氢火焰电离检测器 FID 火焰光度检测器 FPD 1 热导检测器 TCD 1 结构R1R2R3R4是阻值相等的热敏电阻组成惠斯登电桥 2 原理 当参比池与测量池都只有一定流量的载气通过时 电桥平衡 R1R4 R2R3 无信号输出 0mv 走基线 当样品组分 载气通过测量池时 由于组分与载气的导热系数不同 使热敏元件的电阻值和温度发生变化 电桥失去平衡 R1R4 R2R3 AB两端产生电位差 有信号输出 且信号与组分浓度成正比 不同物质具有不同的导热系数100 C时H2AirCCl4N2He单位22 403 140 923 1417 4110 4J cms C 3 TCD使用注意事项 1 为确保热丝不被烧断 在TCD通电前 先开载气关机时一定要先关电源 后关载气 否则检测器会报废 2 载气中含氧气时 使热丝寿命缩短 载气必须除氧 3 不要使用聚四氟乙烯作载气输送管 它会渗透氧气 4 TCD性能与应用 1 属浓度型Det 进样量一定时峰面积A 1 Fd 用A定量时要保持流速恒定 2 属通用型Det 可测多种类型组分特别是可测FID所不能直接测定的许多无机气体 3 是非破坏型Det 利用样品收集或与其他仪器联用 2 氢火焰离子化检测器 FID 1 结构主要是离子室离子室包括 气体入口喷嘴收集极 极化极 2 原理H2 O2燃烧产生2100 C高温 使被测有机组分电离 收集极 与极化极 间加有恒电压 形成一个静电场 所电离的离子 在电场作用下形成离子电流 通过高阻取出讯号 经放大记录下来 3 工作条件a 仪器接地好 屏蔽良好b TDet 120 C 使离子室不积水 TDet要高于Tc20 50 Cc 一般用N2作载气 载气要净化 除有机物d 气体流量H2 N2 Air 1 1 10 4 特点a 属质量型 A与Fd无关属破坏型 不能制备联用b 适用水和大气中痕量有机物 对烃类灵敏度高 比TCD高102 104倍c FID不能检测CO2COH2OH2SCS2N2NH3等无机物 即水与永久气体等 在H2焰中不电离 3 其他检测器 一 ECD1 结构 2 原理 Ni63放射源放射出 射线与载气N2碰撞产生电子 这些电子在电场作用下向收集极移动 形成恒定的基流 当载气中有电负性组分捕获这些低能量的电子 使基流降低 产生倒色谱峰讯号高纯N2载气N2N2 e样品组分AB eAB EAB N2 AB N2 射线 3 工作条件 1 载气纯度 用高纯N2 99 999 含O2 10PPm若用普通N2 含O2100PPm 则必须净化除氧 水等 O2是电负性物质 可使基流降低很多载气流量40 100ml min 2 极化电压 在50mv以内 通常20 50V 极化电压过高使电子能量过大 不易被组分捕获 不能直接供电 而用脉冲供电 使电子能量较小 易捕获 灵敏度提高 4 特点 1 是选择性Det 对卤素及O Cl等化合物响应大对烃类无响应 对CCl4响应值比正己烷大108倍 可与FID组合定性 2 灵敏度高 最低检测限度很低但线形范围窄 3 浓度型Det 峰高定量为宜 4 FPD火焰光度检测器也叫硫磷Det 1 结构 由氢火焰和光度计二部分组成 2 原理 含S P化合物在富氢焰中燃烧产生激发态S2 或发光HPO 同时发射出不同波长的特征光谱S2 的特征光谱为394nmHPO 的特征光谱为526nm此光谱经干涉滤光片选择 将特定波长光输入倍增管产生光电流 放大后记录 3 工作条件 富氢 H2流量150 160ml minN2流量40 50ml min4 特点 质量型Det用于测含S P化合物 信号比C H化合物大10000倍用P滤光片时 P的响应值 S的响应值 20用S滤光片时 S的响应值 P的响应值 10 液相色谱检测器应具有 灵敏度高 噪音低 线性范围宽 定量准确 适应范围广等特点 同时还应该对温度和载液流速的变化不敏感 可用的检测器有 紫外 折光 电导 荧光 极谱等常用的检测器有 紫外 可见光度检测器和差示折光检测器 紫外 可见光度检测器一种小型的装有流动池的双光束光度计紫外 可见光度检测器灵敏度很高 检测限可达10 9g mL 1优点 这种检测器对温度和流速不敏感 适宜于梯度洗提 缺点 不能用于对紫外 可见光完全不吸收的试样的检测 差示折光检测器一种浓度型检测器 是通过连续测定测量池中溶液折射率的变化来测定组分的浓度 优点 凡与流动相折射率不同的组分 都可以用差示折光检测器来检测 所以差示折光检测器是一种通用型检测器 差示折光检测器的灵敏度可达10 7g mL 1 可用于检测在紫外光范围内吸光度不高的化合物 如聚合物 糖 有机酸和甘油三酸酯 缺点 对温度和流速的波动很敏感 Q4色谱仪是如何实现分析的 色谱分析基本原理 气相色谱法的基本理论 1 塔板理论假设 将一根色谱柱视为一个精馏塔色谱柱是由一系列连续的 水平的塔板构成每一块塔板的高度为H组分气体以脉冲的方式进入塔板组分在每一块塔板上迅速达到分配平衡分配系数在各塔板上是常数气体的纵向扩散可以忽略不计 色谱峰的形状 理论上 应得到正态分布的平滑曲线 混合组分的分离 色谱柱的柱效能塔板高度 H L n 理论塔板数 色谱柱长 同长度的色谱柱塔板数越多 塔板高度H越小 分离效果越好 色谱柱的理论塔板数按下式计算 保留时间越长 Y或Y1 2越小 色谱峰越窄 理论塔板数越多 组分在两相间达到分配平衡的次数也越多 分离能力越强 柱效也就越高 例4 2 2某色谱柱长2 1m 测得某组分的保留时间为5min42s 在色谱纸上量得色谱峰的宽度为1 2cm 已知纸速为2cm min 1 求塔板高度 解 将色谱峰的宽度换算成时间 答 塔板高度为1 45cm 有效塔板数 使用调整保留时间tR 计算塔板数 有效塔板数扣除了死时间的影响 较为真实地反映了柱效能的好坏 塔板理论的优点 理论直观 能解释流出曲线的形状和浓度极大点 色谱峰 的位置 应用广泛 缺点 理论建立在几点假设之上 不能解释塔板高度量受哪些因素的影响 也不能指出降低塔板高度的途径 2 速率理论范第姆特方程式 H A B U CU 式中 U为流动相平均线速度 A为涡流扩散项 B U为分子扩散项 CU为传质阻力项 减少A B U CU三项的值 可以降低塔板高度量 减少色谱峰的扩张 提高柱效 涡流扩散项 A A的大小 与填充物的平均颗粒直径dp 单位为cm 有关 也与固定相填充不均匀因子有关 分子扩散项 B U 试样分子沿色谱柱纵的方向扩散 系数B的大小与气体路径弯曲因子 和组分在气体中的扩散系数Dg 单位为cm2 s 1 有关 毛细管柱 1填充柱 1 传质阻力项 CU 定义 被测组分由于浓度不均匀而发生物质迁移过程 称为传质过程 C称为传质阻力系数 传质过程分为 气相传质过程与液相传质过程传质阻力系数C等于气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl之和 C Cg C1 A B U CU越小 色谱柱的塔板高度H越小 柱效率越高 改善柱效率的因素 选择颗粒较小的均匀填料 选用较低的柱温操作 降低担体表面液层的厚度 选用合适的载气及载气流速 流速较小时 分子扩散项成为色谱峰扩张的主要因素 宜用相对分子质量较大的载气 流速较大时 传质项为控制因素 宜用相对分子质量较小的载气 总结 范第姆特方程 H A B U CU 色谱分离条件的选择 1 分离度和影响分离的因素 分离度R的计算定义 两相邻组分保留时间之差与两峰底宽度和之半的比值 色谱柱的选择性越强 两组分的色谱峰相距越远 柱效能越高 色谱峰越窄 R 1时 分离程度为98 7 R 1 5时 分离程度可达99 7 R 1 5作为完全分开的标志 若两组分分离效果较差 可用半峰宽 Y1 2 代替峰底宽 Y 计算分离度 色谱分离基本方程式 由上式可知 1 增加塔板数可以提高分离度 2 K tR t0值的最佳范围是 1 k 10 3 相对保留值 tR 2 tR 1 增大 能显著地提高分离度 两根同种色谱柱的相互关系式 例4 2 3如果柱长L2为1m时 分离度为0 8 要实现完全分离 R 1 5 色谱柱Ll至少应有多长 答 色谱柱至少应有3 52m长 例4 2 4用3m长的填充柱得到如图4 2 6所示的色谱流出曲线 为了得到R 1 5的分辨率 填充柱最短需要多少米 塔板高度为 代入公式 得 解 2 分离条件的选择 载气及其最佳流速的选择 载气的选择热导池检测器常用氢气 氦气作载气氢火焰检测器宜用氮气作载 载气流速的选择范第姆特方程式H A B U CU中 A B C与载气线速度无关 载气的最佳流速 柱温的选择柱温改变时 柱效率 分离度R 选择性及色谱柱的稳定性都将产生相应的改变 汽化温度的选择比汽化室高30 70 或 比试样组分中最高的沸点高30 50 进样时间和进样量在0 1s内把试样样进完液体进样量为0 1 L 5 L气体进样量为0 1mL 5mL 固定相及其选择 1 气 固色谱固定相吸附 物理化学过程吸附剂分类 1 非极性吸附剂 如活性炭 适用于低沸点的碳氢化合物的分析 2 弱极性吸附剂 如氧化铝吸附剂 适用于分析C1 C4烃类及异构体 3 强极性吸附剂 如分子筛 适于分析N2 O2 CO H2等气体和正异构烷烃 4 氢键型吸附剂 如硅胶吸附剂 适用于分析有氢键或极性的化合物 2 气 液色谱固定相气 液色谱的优点 1 固定液的品种繁多 可选择范围大 2 固定液的用量可以任意变化 可以根据需要选用合适的固定液用量 以改善分离效果 3 气 液色谱在通常操作条件下有良好的对称峰 寿命长 担体担体的作用是提供一个很大的惰性表面 使固定液以薄膜状态分布在其表面上有白色硅藻土担体和红色硅藻土担体两类 担体的选择的基本原则 1 固定液用量在5 以上的 采用硅藻土型担体 固定液用量在5 以下的 采用表面处理过的担体 2 高沸点组分的分离 由于控制的柱温 色谱柱温度 较高 使用玻璃微球作担体 3 对高腐蚀性的组分 应选用抗腐蚀性强的聚四氟乙烯担体 氟担体 担体的粒度常选用60目 80目或80目 100目 高效柱可选用100目 120目 固定液 对固定液的要求 1 难以挥发 热稳定性好 在工作柱温下 固定液粘度小 能均布在担体表面上形成液膜 3 对被测组分有一定的溶解度且有较高的选择性 化学稳定性好 在操作条件下 固定液不与载气 担体 被测组分发生不可逆的化学反应 固定液的分类主要是按固定液的极性分级 0 级 非极性固定液 1 与 2 级 弱极性固定液 3 级 中等极性固定液 4 与 5 级 强极性固定液 固定液的选择原则 1 非极性试样 用非极性固定液 2 极性试样 使用极性固定液 3 极性与非极性的混合物 一般选用极性固定液 4 能形成氢键的试样 选用极性或形成氢键的固定液 5 复杂的多组分混合试样 常用两种或两种以上的混合固定液 气相色谱分析1 气相色谱的定性方法 依据 利用色谱图确定各色谱峰所代表的化合物 常用的方法 纯物质对照定性 利用保留值定性 利用检测器的选择性定性等 根据色谱保留值进行定性分析各种物质在一定的条件下 固定相 操作条件 均有确定不变的保留值利用已知成分的纯物质与未知试样的色谱峰对照进行定性分析 利用保留值定性当已知某试样推测为某化合物 例如已用其他方法确定 时 用相应化合物的纯物质进行比较 有相同的峰形和保留值的则为同一种化合物 特点 气相色谱定性最可靠的方法 混合物中丙醇的定性 在同一色谱柱中 注入色谱纯丙醇 注意 如果保留时间相同 峰形不同 仍不能认为是同一种物质时 将试样与纯物质混合后注入色谱柱 若色谱峰增高而半峰宽并不相应增加 则两者可能是同一种物质 缺点 重复性较差 利用相对保留值定性定义 相对保留值是组分i与基准物S的调整保留值之比 优点 可以消除某些操作条件的影响 只要柱温 固定相不变 即使柱径 柱长 填充情况及流动相的流速有所变化 相对保留值 仍然不变 它是色谱定性分析的重要参数 利用检测器的选择性进行定性分析热导池检测器 TCD 对有机化合物和无机化合物均有响应 但灵敏度较低 氢焰检测器 FID 对有机化合物灵敏度高 对无机气体 水分等响应很小 电子捕获检测器 ECD 对卤素 氧 氯等电负性强的组分有很高的灵敏度 对不含卤素 氧 氮等电负性强的组分灵敏度很低 甚至不产生响应 火焰光度检测器 FPD 只对含S P的物质有信号 利用检测器定性 可以大致判断被测物的类型 2 气相色谱定量方法依据 在一定的条件下 被测组分i的质量mi或其在载气中的浓度与检测器的响应信号 色谱上表现为峰面积Ai或峰高Hi 成正比 色谱峰面积测量方法 峰高乘半峰宽法 峰高乘平均峰宽法在峰高0 15处与峰高0 85处测量峰的宽度 然后取平均值 乘以峰的高度 定量校正因子原因 为了使检测器的响应信号能真实地反映物质的含量 就要对色谱峰面积进行校正 因此引入定量校正因子 物理意义是每单位峰面积所代表物质的多少 绝对校正因子在一定的操作条件下 组分i的进样量m与峰的面积Ai成正比 绝对校正因子 进样量 质量m 摩尔n 体积V 例4 2 7某试样含有5 g乙醇 测得相应的色谱峰面积为150mm2 求乙醇的fi 解 答 乙醇的绝对校正因子fi为3 3 10 2 g mm 2 即每平方毫米色谱峰面积代表3 3 10 2 g乙醇 绝对校正因子fi的大小主要由操作条件和仪器的灵敏度所决定 既不容易准确测量 也无统一标准 当操作条件波动时 fi也发生变化 故fi无法直接应用 定量分析时 一般采用相对校正因子 相对校正因子定义 规定某一个组分为标准物 计算其他组分的绝对校正因子与此标准物绝对校正因子的比值 例4 2 8准确称取一定质量的色谱纯对二甲苯 甲苯 苯及仲丁醇 混合后稀释 采用氢焰检测器 定量进样并测量各物质所对应的峰面积 数据如下 物质苯仲丁醇甲苯对二甲苯m g0 47200 63250 81490 4547A cm22 603 404 102 20以仲丁醇为标准 计算各物质的相对质量校正因子 法1 法2 同理 相对响应值 相对灵敏度 物质i与标准物质S的响应值 灵敏度 之比 当单位相同时 它与相对校正因子互为倒数 相对响应值和相对校正因子只与试样 标准物质以及检测器类型有关 与操作条件 柱温 载气流速 固定液浓度及载气的性质等因素无关 因而是能够通用的常数 定量计算方法归一化法 内标法 内标标准曲线法 外标法等 归一化法设有几个组分 每个组分的质量分别为m1 m2 m3 测得色谱峰的面积分别为 A1 A2 A3 各组分的绝对校正因子为 设以第二个组分为标准物 则各组分的相对校正因子为 各组分的质量分数为 各组分的质量分数之和等于1 即 优点 归一化法很直观 容易接受 计算简便 准确 当操作条件如进样量 流速等发生变化时 对计算结果的影响很小 是一种常用的计算方法 缺点是 必需所有组分都出峰 内标法当只需测定试样中某几个组分 或试样中所有组分不可能全部出峰时 可采用内标法 内标法是将一定质量的纯物质 非被测组分的纯物质 作为内标物 加入到准确称取的试样中 根据被测物质和内标物的质量及其在色谱图上相应峰面积之比 求出被测组分的质量分数 设样品的质量为m 则待测组分i的质量分数为 选择内标物应遵循的原则 试样中不存在的纯物质 否则会使色谱峰重叠而无法准确测定试样的色谱峰面积 内标物的物理及物理化学性质应与被测物相近 当操作条件发生变化时 内标物与被测物均受到相应的影响两者相对校正因子基本不变 色谱峰位于被测物色谱峰的附近 且能与被测物色谱峰完全分离 内标物的浓度应与被测物的浓度相近 例4 2 9取二甲苯生产母液1500mg 母液中合有乙苯 对二甲苯 邻二甲苯 间二甲苯及溶剂和少量苯甲酸 其中苯甲酸不能出峰 以150mg壬烷作内标物 测得有关数据如下 物质壬烷乙苯对二甲苯间二甲苯邻二甲苯Ai cm298709512080f m1 020 971 000 960 98求各组分的含量 解 母液中苯甲酸不能出峰 所以只能用内标法计算 由各组分的绝对校正因子计算得壬烷 乙苯 对二甲苯 间二甲苯 邻二甲苯的相对校正因子分别为1 00 0 95 0 98 0 94 0 96 根据内标法计算公式 对于乙苯有 同样可以计算出对二甲苯 间二甲苯 邻二甲苯的质量分数分别为9 5 11 5 7 84 内标法的优点 不要求各组分全部出峰 无归一化法的限制 即只要被测组分能出峰 不和其他峰重叠 不管其他组分是否出峰或是否重叠 都可以用内标法进行定量分析 而且定量准确 受操作条件影响较小 缺点 选用合适的内标物较为困难 每次都要淮确称量样品和内标物的量 不宜作快速分析 内标标准曲线法从内标公式可知 如果每次称取同样量 m 的试样 每次加入相等量 ms 的内标物 则上式中m ms均为常数 计算公式可写为 高效能 毛细管柱可达104块 105块理论塔板 可以分析沸点十分相近的组分和极为复杂的多组分混合物 高选择性 可分离同系物 同分异构化合物 气相色谱法的特点 痕量杂质分析 可以测出超纯气体 高分子单体 高纯试剂中质量分数为10 6 10 10数量级的杂质大气污染物分析 可以直接检出质量分数为10 9数量级的痕量毒物农药残留物的分析 可以检出农副产品 食品 水质中质量分数为10 6 10 9数量级的氯 硫 磷化合物 分析速度快 一般分析可在几分到几十分内可以完成 某些快速分析1s内可以分析数个组分 高灵敏度 液 固色谱法液 液色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法 高效液相色谱法的分类及其分离原理 1 液 固色谱法 液 固吸附色谱法 固定相是固体吸附剂 它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的 液 固色谱法的作用机制吸附剂 一些多孔的固体颗粒物质 其表面常存在分散的吸附中心点 流动相中的溶质分子X 液相 被流动相S带入色谱柱后 在随载液流动的过程中 发生如下交换反应 X 液相 nS 吸附 X 吸附 nS 液相 其作用机制是溶质分子X 液相 和溶剂分子S 液相 对吸附剂活性表面的竞争吸附 吸附反应的平衡常数K为 K值较小 溶剂分子吸附力很强 被吸附的溶质分子很少 先流出色谱柱 K值较大 表示该组分分子的吸附能力较强 后流出色谱柱 发生在吸附剂表面上的吸附 解吸平衡 就是液 固色谱分离的基础 液 固色谱法的吸附剂和流动相常用的液 固色谱吸附剂 薄膜型硅胶 全多孔型硅胶 薄膜型氧化铝 全多孔型氧化铝 分子筛 聚酰胺等 一般规律 对于固定相而言 非极性分子与极性吸附剂 如硅胶 氧化铜 之间的作用力很弱 分配比k较小 保留时间较短 但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强 分配比k大 保留时间长 对流动相的基本要求 试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相 甲醇 乙醚 苯 乙腈 乙酸乙酯 吡啶等 液 固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物 含有不同类型或不同数量官能团的有机化合物 以及有机化合物的不同的异构体 但液 固色谱法不宜用于分离同系物 因为液 固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高 2 液 液色谱法 液 液分配色谱法 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相 液 液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时 在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液 在色谱柱中向前迁移速度较快 在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液 在色谱柱中向前迁移速度较慢 从而达到分离的目的 液 液色谱法与液 液萃取法的基本原理相同 均服从分配定律 K值大的组分 保留时间长 后流出色谱柱 正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相 非极性溶剂 如苯 正己烷等 作流动相 反相分配色谱用非极性物质作固定相 极性溶剂 如水 甲醇 己腈等 作流动相 一般地 正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性 而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性 正相色谱适宜于分离极性化合物 反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物 液 液色谱法的固定相常用的固定液为有机液体 如极性的 氧二丙腈 ODPN 非极性的十八烷 ODS 和异二十烷 SQ 等 缺点 涂渍固定液容易被流动相冲掉采用化学键合固定相则可以避免上述缺点使固定浓与担体之间形成化学键 例如在硅胶表面利用硅烷化反应 形成Si O Si C型键 把固定液的分子结合到担体表面上 优点 化学键合固定相无液坑 液层薄 传质速度快 无固定液的流失固定液上可以结合不同的官能团 改善分离效能固定液不会溶于流动相 有利于进行梯度洗提 液 液色谱法的应用液 液色谱法既能分离极性化合物 又能分离非极性化合物 如烷烃 烯烃 芳烃 稠环 染料 留族等化合物 化合物中取代基的数目或性质不同 或化合物的相对分子质量不同 均可以用液 液色谱进行分离 3 离子交换色谱法原理 离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换 由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力 作用力 而被分离 离子交换色谱法的作用机制聚合物的分子骨架上连接着活性基团 如 SO32 N CH3 3 等 为了保持离子交换树脂的电中性 活性基团上带有电荷数相同但正 负号相反的离子X 称为反离子 活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换 K值越大 保留时间越长 离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程 交换达到平衡时 溶剂和固定相两种类型 多孔性树脂与薄壳型树脂多孔性树脂 极小的球型离子交换树脂 能分离复杂样品 进样量较大 缺点是机械强度不高 不能耐受压力 薄壳型离子交换树脂 在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂 这种树脂柱效高 当流动相成分发生变化时 不会膨胀或压缩 缺点是但柱子容量小 进样量不宜太多 离子交换色谱法的应用主要用来分离离子或可离解的化合物 凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离 广泛地应用于 无机离子 有机化合物和生物物质 如氨基酸 核酸 蛋白质等 的分离 4 凝胶色谱法 空间排阻色谱法 凝胶是一种多孔性的高分子聚合体 表面布满孔隙 能被流动相浸润 吸附性很小 凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的 凝胶色谱法的作用机制 体积大于凝胶孔隙的分子 由于不能进入孔隙而被排阻 直接从表面流过 先流出色谱柱 小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻 然后又从孔隙中出来随载液流动 后流出色谱柱 中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中 但受到较小孔隙的排阻 介乎上述两种情况之间 凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法 凝胶色谱法的固定相软质凝胶 半硬质凝胶和硬质凝胶三种 凝胶色谱法的应用特点 保留时间是分子尺寸的函数 适宜于分离相对分子质量大的化合物 相对分子质量在400 8 105的任何类型的化合物 保留时间短 色谱峰窄 容易检测 固定相与溶质分子间的作用力极弱 趋于零 柱的寿命长 不能分辨分子大小相近的化合物 分子量相差需在10 以上时才能得到分离 高效色谱分离的选择1 高效色谱法的运用范围 气相色谱法适用于分析相对分子质量较小 容易挥发成气体的物质 气相色谱法控制温度可达300 热稳定性差的物质在此温度下将发生分解 但高沸点物质在此温度下也不能完全气化 高沸点 热稳定性差的有机化合物 以及相对分子质量大 大于400 的有机物 约占有机物总数的70 80 均不宜应用气相色谱法进行分析 但可以应用高效液相色谱法进行分析 高效液相色谱法在常温下进行分离与分析 不会导致被测物质的热分解 其流动相是液体 所以只要试样能制备成溶液 原则上都可以用高效液相色谱法分离与分析 如离子型化合物 不稳定天然产物以及氨基酸 蛋白质等高分子化合物均可用高效液相色谱法获得较好的分离效果 2 高效液相色谱分离方法的选择 选择的基本依据相对分子质量的大小 对于相对分子质量在200以下 易挥发 热稳定性好的化合物 可采用气相色谱法 相对分子质量在200 2000的化合物 可用液 固色谱法 液 液色谱法 离子交换色谱法 相对分子质量大于2000的试样 适宜用凝胶色谱法进行分离 试样的溶解性 能迅速溶于水的样品 可采用反相液 液色谱法 若试样全部或大部分能溶于HCl或NaOH溶液 表示试样属于离子型化合物 可采用离子交换色谱法来分离 溶于非水溶性溶剂 如己烷 异辛烷 苯 甲苯等烃类 的试样 可选用液 固吸附色谱法 溶于二氯甲烷或三氮申烷的试祥 选用常规的液 液色谱 正相色谱 法和吸附色谱法 溶于甲醇等溶剂的试样 则可以用反相液 液色谱法进行分离与分析 各类物质常用的分离方法 梯度洗提应用梯度洗提 可以提高分离效果 梯度洗提法 在分离的过程中 应用梯度洗提装置 按一定的程序改变两种或两种以上不同极性的溶剂之间的比例 使流动相的成分和极性产生相应的变化 从而改变复杂物质中不同极性的组分的相对保留值 提高分离效果 加快分析速度 样品衍生化在液相色谱分析前 把样品制成衍生物 不仅可以提高从样品基体中萃取和预分离待测化合物的能力 而且可以通过降低样品的极性或改变样品组分的选择性来改善液相色谱分离 还可以改变样品中不同化合物的相对检测器相应 因而可在有谱带重叠的情况下 检测和定量待测组分中的某些组分 有 紫外衍生化 荧光衍生化 电化学衍生化 柱后或柱前衍生化 例题 环境样品中内分泌干扰素的分析 流动相 乙腈 A 和水 B 采用梯度淋洗 体积分数10 A 10min 55 A 10min 85 A 7 5min 10 A 35min 柱温 30 进样量 40 L检测波长 225nm 样品预处理 HPLC Q5什么是离子色谱 例 能够一次完成水样中的无机阴离子 如Cl PO43 SO42 NO3 F 以及Br 等的定性与定量分析吗 利用色谱技术测定离子型物质的方法色谱 用于分析的一种分离技术离子型物质 在水溶液中电离 具有 或 电荷的元素阴离子 2 阳离子 离子型化合物的测定是经典分析化学的主要内容 对阳离子分析 有快速而灵敏的AAS ICP MS XFS 而阴离子的分析在离子色谱发明前一直缺乏一种快速灵敏的方法 1975年 美国Dow化学公司的H Small T S Steven W C Bauman发表了第一篇IC论文 在论文中离子交换分离 抑制电导检测的新思维 Q6离子色谱的工作机理是什么 是如何实现离子分离和分析的 离子色谱的基本流程图 淋洗液 泵 色谱柱 检测器 泵液 分离 检测 记录 进样阀 抑制器 检测池 进样 分离的方式 离子排斥 离解常数和疏水性离子对 RP 对离子对试剂的亲和力离子对化合物的疏水性离子抑制 RP 在特定pH下的疏水性反相 疏水性 离子交换 离子价态和离子半径 Temporalcourse 1 离子交换分离机理 Cl 和SO42 对固定相具有不同的亲和力 SO42 被较强地保留并且在Cl 之后洗脱 IC的分离机理是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换 依据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离 它是离子色谱的主要分离方式 用于亲水性阴 阳离子的分离 典型的离子交换模式是样品溶液中的离子与分析柱的离子交换位置之间直接的离子交换 如用Na2CO3 NaHCO3作淋洗液分析水中的F Cl 和SO42 首先用淋洗液平衡阴离子交换分离柱 再将进样阀切换到进样位置 高压泵输送淋洗液 将样品带入分离柱 待测离子从阴离子交换树脂上置换 CO32 HCO3 基 并暂时而选择地保留在固定相上 同时 保留的阴离子又被淋洗液中的 CO32 HCO3 基置换并从柱上被洗脱 对树脂亲和力较 CO32 HCO3 弱的阴离子 如Cl 较对阴离子交换位置亲和力强的阴离子 如SO42 通过柱子快 这个过程决定了样品中阴离子之间的分离 经过分离柱之后 洗脱液先后通过抑制器和电导池 电导检测 非抑制型离子色谱中 洗脱液直接进入电导池 分离阴离子 Column IonPacAG12A AS12AEluent 2 7mMNa2CO30 3mMNaHCO3Flowrate 1 2mL minDetection Conductivity ASRSRecyclemode 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Retentiontime min 0 8 mS Column IonPacCS12A CG12AEluent 20mMMethanesulfonicacidFlowrate 1 0mL minDetection Conductivity CSRSRecyclemode 分离阳离子 0 2 4 6 8 10 12 14 Retentiontime min 0 1 2 3 4 S 2 离子排斥法分离机理 Donnanmembrane 固定相 流动相 HPIEC分离柱较大 9mm 250mm 柱中填充粒度均匀的总体磺化的高容量阳离子交换树脂 分离机理基于Donnan排斥 空间排阻和吸附3种 上图表示在HPIEC柱上发生的分离过程简图 表明了树脂表面以及键合在上面的磺酸基 SO3 若纯水通过分离柱 会围绕磺酸基形成一水合壳层 与流动相中的水分子相比 水合壳层的水分子排列在较好的有序状态 在这种保留方式中 类似Donnan膜的负电荷层 表现出水合壳和流动相之间界面的特性 这个壳层只允许未解离的化合物通过 完全离解的盐酸淋洗液不能透过这个壳层 因为Cl 的负电荷而被排斥 不能接近或进入固定相 另一方面 中性的水分子可进入树脂的孔穴并回流到流动相 有机弱酸 如乙酸 被洗入柱子之后 根据淋洗液的pH 它可处于部分未理解的形式 因而不受Donnan排斥 虽然乙酸和水可与固定相作用 但乙酸在固定相表面发生了吸附 因此 这种一元脂肪羧酸的分离机理包括Donnan排斥和吸附两种 保留时间随酸的烷基键长的增加而增加 加入有机溶剂乙腈或丙醇到淋洗液中 脂肪一元酸的保留时间缩短 这说明有机溶剂分子阻塞了固定相的吸附位置 同时增加了有机酸在流动相中的溶解度 二元或三元羧酸 如草酸和柠檬酸 在排斥和总的渗透体积之间洗脱 除Donnan排斥之外 起主要作用的分离机理还包括空间排阻 保留与样品分子的大小有关 因为树脂的微孔体积是由树脂的交联度决定的 所以改善分离度的一种方法是改变固定相的交联度 Column IonPacICEAS1Eluent 0 4mMOctonesulfonicacidFlowrate 1 0mL minSuppressor AMMS ICE Regeneratorliquid 5mMTBAOH 50mMH3BO3Detection Conductivity 离子排斥法分离有机酸 20 10 0 保留时间 min 0 S 5 1 2 3 4 5 1 甲酸2 乙酸3 丙酸4 丁酸5 戊酸 MobilephaseTBAOH ACN H2OSampleY X 固定相 TBA OH Y X Y X TBA X TBA X TBA X TBA X TBA OH ACN ACN ACN ACN ACN ACN ACN TBA OH TBA OH 疏水相 亲水相 Y OH 3 反相离子对分离机理 原理 将一种 或多种 与溶质离子电荷相反的离子 对离子或反离子 加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物 使其能够在两相之间进行分配 阴离子分离 常采用烷基铵类 如氢氧化四丁基铵 TBAOH 或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子 阳离子分离 常采用烷基磺酸类 如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱 非极性的疏水固定相 C 18柱 含有对离子TBA 的甲醇 水或乙腈 水作为流动相 试样离子X 进入流动相后 生成疏水性离子对TBA X 后 在两相间分配 反相离子对的分离机理 1 生成离子对 待测离子与离子对试剂生成中性 离子对 分布于固定相与流动相之间 其分离类似传统的反相分离 2 动态离子交换 离子对试剂的疏水部分吸附于固定相形成动态的离子交换表面 其分离机理类似于离子交换 3 离子间相互作用 除包括以上两种分离机理和固定相表面双电层结构的分离机理 Column IonPacNS1 NG1Eluent 2mMTBAOH 24 48 CANgradientin10minFlowrate 1 0mL minDetection Conductivity suppressortype ASRSMPICMode Regenerator 10mNH2SO41 Methanesulfonicacid5 0 g mL ppm 2 1 Propanesulfonicacid8 63 1 Butanesulfonicacid8 74 1 Hexanesulfonicacid8 85 1 Heptanesulfonicacid8 96 1 Octanesulfonicacid8 97 1 Decanesulfonicacid9 1 0 Retentiontime min 12 16 8 S 0 0 4 8 0 反相离子对分离测定 Q6离子色谱分析过程中检测器是如何消除反相离子干扰的 检测方式 电导检测具有电导