WB检测蛋白实验报告范本 - 上海秉新生物科技有限公司.doc

时间就是金钱，效率就是生命！实验报告书项目名称：Western blotting检测组织中蛋白表达客户姓名：合同号：项目负责人一、 实验仪器与试剂表格一：实验仪器仪器厂家型号小型垂直电泳槽Biorad164-8001转印槽BioradTrans-Blot脱色摇床常州澳华TY-80B电泳仪上海天能EPS-200低温高速离心机64RBECKMAN酶标仪 Thermo ScientificMultiskan Spectrum表格二：试剂试剂厂家RIPA裂解液碧云天PMSFAmrescoBCA蛋白定量试剂盒ThermoTrisAmresco甘氨酸Amresco盐酸国药集团甲醇国药集团Tween 20国药集团SDS国药集团TEMEDSigmaBSASigmaPVDF膜MilliporeHRP标记的羊抗小鼠二抗联科生物化学发光检测试剂ThermoGAPDH鼠单克隆抗体联科生物预染蛋白marker碧云天X光胶片柯达二、 实验步骤1、 组织中蛋白上清液的制备和浓度测定(1) 把组织剪切成细小的碎片；(2) 加入200L裂解液，在匀浆机中研磨，直至裂解液中组织消失；(3) 充分裂解后，12000rpm离心5min，取上清。(4) 取部分上清蛋白用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按如下步骤： 按试剂盒说明书将A液和B液以50：1的比例配制成工作液；取2000g/mL的BSA标准品，用PBS(pH 7.4)稀释成2000g/mL、1500g /mL、1000g/mL、750g/mL、500g/mL、250g/mL、125g/mL、25g/mL、0g/mL共9个浓度梯度；取上清液10L，用PBS稀释20倍；每管中加20L蛋白标准品或稀释后的上清液，再加上述工作液0.2mL，37孵育30min，562nm处测吸光度，记录OD值；根据蛋白标准品的浓度及相应OD值绘制标准曲线：根据标准方程计算样品总蛋白浓度（mg/mL）样品123456789OD值0.8176110.4384120.6577160.6756170.3625680.8177740.6880890.4775460.6275110.9913140.5170180.8148460.7480830.4604700.6229990.5744480.4045160.700393均值0.9044620.4777150.7362810.7118500.4115190.7203860.6312680.4410310.663952浓度 mg/mL21.469.2716.6615.967.3816.2113.668.2214.592、Western-Blot检测总蛋白中目的蛋白表达。(1) 灌胶蒸馏水清洗灌胶玻璃板，竖直晾干。配制13分离胶10mL，加TEMED10L、10过硫酸铵100L，混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘23mm（事先做好标记），用异丙醇封闭液面以去除气泡并隔绝空气，室温静置45min待胶完全聚合。待分离胶完全聚合后，倾去其顶部的去离子水，用滤纸将水吸干。配制4浓缩胶 5 mL，加TEMED 5 L、10APS 50 L，混匀立即灌胶，灌至顶部，并垂直插入Teflon齿梳，室温静置 20 min待胶聚合。待胶完全聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。(2) 电泳取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度为6g/L，和等体积2上样缓冲液混合，即为上样液。将上样液于100沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000转/min离心1min。每孔加上样液15L，留一孔加10L预染的Marker。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用80v恒压电泳，约20min，当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用110v恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。(3) 转印蛋白及免疫检测在电泳即将结束前，预先将PVDF膜浸泡在甲醇中15s，然后用ddH2O漂洗2min，浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡15min。按黑面（负极）海绵滤纸胶PVDF膜滤纸海绵红面（正极）的顺序制备转膜“三明治”，每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的产生。接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中，加入转膜缓冲液。将电转仪置于冰水中，100V恒压转膜1h。转膜结束后，快速取出PVDF膜，放入5%BSA室温封闭2h。取出膜，于摇床上用TBST洗膜5min3次。孵育袋中加入TBST稀释的一抗（1：500）4孵育过夜。TBST洗膜5min3次，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠二抗（1：3000），室温孵育1h。TBST洗膜10min3次。膜于化学发光检测试剂反应至暗处出现亮条带，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用X胶片感光、显影、定影。三、 实验结果目的蛋白GAPDH 样本编号123456789目的蛋白66025696137267770136001257421220162374175GAPDH488884054937709315313