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第三章蛋白质 protein 123页第3 4 5 6 7章 第一节氨基酸第二节蛋白质概述第三节蛋白质的共价结构第四节蛋白质的三维结构第五节蛋白质结构与功能的关系第六节蛋白质的性质 分离与纯化 1 2 蛋白质的概念 存在于所有的生物细胞中 是由20种 氨基酸按一定的序列通过酰胺键 蛋白质化学中称为肽键 缩合而成的 具有较稳定的构象 是构成生物体最基本的结构物质和功能物质 有些蛋白质尚含有非蛋白成分 3 第一节氨基酸 aminoacid 123页 一 氨基酸 蛋白质的构件分子二 氨基酸的分类三 氨基酸的酸碱化学四 氨基酸的化学反应五 氨基酸的光学活性和光谱性质六 氨基酸混合物的分析分离 4 一 氨基酸 蛋白质的构件分子 蛋白质水解氨基酸的一般结构 5 1 蛋白质的水解 完全水解 常见蛋白质氨基酸 基本氨基酸 20种 不常见的蛋白质氨基酸 几种 6 2 氨基酸的一般结构 20种基本氨基酸 结构通式结构特点其它特性 7 1 结构通式 8 构型 氨基酸的构型指 碳的构型 D与L型 组成蛋白质的氨基酸是L 型 9 除脯氨酸为 亚氨基酸外 均为L 氨基酸 除甘氨酸外 碳原子为不对称碳原子 都具有旋光性 2 结构特点 10 其它特性124页 在中性pH时 兼性离子 都有特殊的白色结晶形状 可用来鉴别氨基酸 溶点很高 除胱氨酸和酪氨酸外 一般都能溶于水 11 二 氨基酸的分类 体内氨基酸 常见的蛋白质氨基酸 20种 不常见的蛋白质氨基酸 少数几种 非蛋白质氨基酸 150多种 12 1 常见的蛋白质氨基酸 20种 124页表3 1 13 按R基团的化学结构 脂肪族氨基酸 15种 芳香族氨基酸 3种 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 杂环氨基酸 2种 组氨酸 脯氨酸 14 根据侧链R基团的极性 127页表3 2 带正电荷的极性R基氨基酸 3种 带负电荷的极性R基氨基酸 2种 不带电荷的极性R基氨基酸 7种 非极性R基氨基酸 8种 非极性氨基酸在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用 分子极性 15 按分子中氨基和羧基的数目 酸性氨基酸 2种碱性氨基酸 3种中性氨基酸 其余 16 根据人体能否自身合成 必需氨基酸 8种赖氨酸 Lys 缬氨酸 Val 蛋氨酸 Met 色氨酸 Try 亮氨酸 Leu 异亮氨酸 Ile 苏氨酸 Thr 苯丙氨酸 Phe 半必需氨基酸 2种 Arg His婴儿期供给不足 非必需氨基酸 其余 要求记住 氨基酸的结构 单字符 三字符号第125 127页 17 C C CONH2 C CONH2 C COOH C C COOH H CH3 C OH C SH C C S C C C C C NH3 Centralline Aliphatic Amide Acidic Imino Circular Basic Sulfur Hydroxy Aromatic 18 2 不常见的蛋白质氨基酸128页 是在蛋白质合成后由常见的氨基酸经修饰而来的 19 3 非蛋白质氨基酸129页 大多是L 氨基酸衍生物细菌中含有多种D 型氨基酸有一些是重要的代谢物前体或代谢中间物 丙氨酸 鸟氨酸 瓜氨酸等 20 三 氨基酸的酸碱化学129页 氨基酸的兼性离子形式氨基酸的解离氨基酸的等电点氨基酸的甲醛滴定 21 1 氨基酸的兼性离子形式 两个事实溶点高 离子晶格能使水的介电常数增高 22 2 氨基酸的解离 酸碱质子理论 丹麦化学家布朗斯特和英国化学家劳里于1923年提出HA BA BH氨基酸是一类两性电解质 完全质子化时 多元酸 23 甘氨酸的解离 分步解离 24 解离常数131 133页表3 3 解离常数pKa 表示解离基团有一半解离时的pH A A0 H A H 解离常数按酸性递减顺序编号为 pKa1 pKa2 pKa3等 氨基酸的解离常数用测定滴定曲线方法求 25 26 氨基酸的解离常数用测定滴定曲线方法求 甘氨酸的滴定曲线 27 谷氨酸的滴定 解离 曲线 28 组氨酸的滴定 解离 曲线 29 赖氨酸的滴定 解离 曲线 30 Handerson Hasselbalch公式 pH pKa lg A HA pKa lg 碱 酸 可计算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关 31 例 计算在pH5 0时 甘氨酸的阳离子 两性离子所占的比例 32 生理条件下有明显的冲缓作用的氨基酸132页 缓冲剂 能阻止由于酸或碱的加入而引起的 H 的变化 组氨酸侧链咪唑基的pK为6 0 33 3 氨基酸的等电点 isoelectricpoint pI 133页 等电点 当溶液pH低于该氨基酸等电点时 氨基酸净电荷为正 反之为负 氨基酸在等电点时溶解度最低 不同氨基酸等电点不同 34 应用根据氨基酸的电荷不同 电泳法 离子交换层析 分离混合物 根据氨基酸的等电点不同 调节溶液pH 分离混合物 电泳在外电场的作用下 带电颗粒 如不处于等电点状态的分子 将向着与电性相反的电极移动 这种现象称为 35 等电点的计算133页表3 3 1 侧链不解离的中性氨基酸pI pK1 pK2 22 侧链含有可解离基团的氨基酸酸性氨基酸pI pK1 pKR2 2硷性氨基酸pI pK2 pKR3 2半胱氨酸pI pK1 pKR2 2酪氨酸pI pK1 pKR2 2 36 4 氨基酸的甲醛滴定 氨基酸不能直接用酸 碱滴定来进行定量测定 氨基中的氮原子是亲核中心 可发生亲核加成和取代反应 与甲醛发生羟甲基化反应 37 四 氨基酸的化学反应135页 氨基参加的反应 羧基参加的反应 氨基和 羧基共同参加的反应侧链R基参加的反应 38 1 氨基参加的反应 与亚硝酸反应与酰化试剂反应烃基化反应生成西佛碱的反应 Schiff 脱氨基反应与转氨基反应 见下册 39 1 与亚硝酸反应 是范斯莱克氨基氮测定法 vanSlykeaminonitrogenmethod 的原理 40 2 与酰化试剂反应 用于多肽链N末端aa的标记和微量aa的定量测定 在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护剂 弱碱性溶液 丹磺酰氯 41 3 烃基化反应 首先被Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的N末端氨基酸 DNP 氨基酸黄色 2 4 二硝基氟苯 弱碱性溶液 DNFB或FDNB 亦称Sanger试剂 2 4 二硝基氟苯 DNFB或FDNB亦称Sanger试剂 42 43 FrederickSanger 桑格 英国化学家 在生物化学领域的贡献很大 他两次获诺贝尔奖1958和1980年 1953年确定了牛胰岛素一级结构 1975年和1977年确定了DNA的两种用酶测序的方法加减法和终止法 44 首先被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸 苯异硫氰酸酯缩写为 与苯异硫氰酸酯PITC 45 Edman法测定氨基酸序列 46 4 生成西佛碱的反应 西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应的中间物 47 2 羧基参加的反应第138页 成盐和成酯成酰氯反应脱羧基反应叠氮反应 48 3 氨基和 羧基共同参加的反应 与茚三酮反应成肽反应 49 1 与茚三酮反应 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热 所有具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物 570 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成的是黄色化合物 440 50 2 成肽反应 51 3 侧链R基参加的反应140页 蛋白质的化学修饰 就是在较温和的条件下 以可控制的方式使蛋白质与某些试剂起特异反应 以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变 酪氨酸的酚基Millon反应 红色 Foiln反应 蓝色 Pauly反应 橘黄 碘化 硝化精氨酸的胍基 坂口反应 红色 与环已二酮生成缩合物 苯丙氨酸和酪氨酸的苯环 黄色反应 黄色 组氨酸的咪唑基 Pauly反应 棕红色 苏氨酸和丝氨酸的羟基 成酯反应Cys侧链上的巯基 SH 52 Cys侧链上的巯基 SH CH2 S 此阴离子是巯基的反应形式 53 与卤化烷生成稳定的烷基衍生物 可保护 SH以防被氧化 54 Cys巯基打开氮丙啶的环 为胰蛋白酶水解肽链提供了新的位点 AECys 55 巯基能和各种金属离子形成络合物 SH酶遇到重金属离子而生成硫醇盐时 将导致酶失活 对羟基汞苯甲酸 56 与二硫硝基苯甲酸 DTNB 反应 pH8 0时 在412nm波长处有强烈吸收 可用比色法定量测定半胱氨酸的含量 硫硝基苯甲酸 57 巯基易受空气或其他氧化剂氧化 两种氧化衍生物 形成二硫化物 胱氨酸的形成 胱氨酸 二硫键 58 形成磺酸基 对游离的巯基具有保护作用 保护Cys巯基之间的氧化 59 二硫键的还原 打开 SH与 S S 是一对氧化还原体系 常用的打开二硫键的试剂主要有 氧化剂 过甲酸 HCOOOH 还原剂 巯基乙醇 巯基乙酸 二硫苏糖醇等 HSCH2CH2OH 60 氧化剂 过甲酸 HCOOOH 磺酸基 61 还原剂 巯基乙醇 游离的巯基极易被氧化 需与卤化烷试剂作用将其保护 62 63 五 氨基酸的光学活性和光谱性质143页 氨基酸的旋光性氨基酸的光谱性质 64 消旋作用 外消旋物与内消旋物 65 氨基酸的光谱性质145页 可见光区都没有光吸收红外区和远红外区都有吸收 200nm 近紫外区 200nm 400nm 色氨酸280nm酪氨酸275nm苯丙氨酸257nm 66 六 氨基酸混合物的分析分离 分配层析法的一般原理纸层析柱层析离子交换层析气液层析薄层层析高效 压 液相层析HPLC 67 1 分配层析法的一般原理 固定相流动相 层析系统 固相液相半液相 液相气相 68 分配定律及分配系数 混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相分配系数 69 逆流分溶原理149页 混合物中Y Kd 1 Z Kd 3 计算公式150页 70 一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时 转移次数越多 即分溶管数越多 其分溶曲线越集中 即峰形越窄而高 这样有利于混合物中各物质的完全分离 71 2 纸层析 支持物 纸 纸上的羟基具有亲水性 因此能吸附一层水作为固定相 而通常有机溶剂作为流动相 溶剂 酸溶剂系统和碱溶剂统 原理 是根据混合物中溶质物质的极性造成的分配系数不同进行分离的 72 相对迁移率Rf X Y 73 1 点样 纸层析操作 2 展层 3 显色 4 分析 74 离子交换柱层析152页 填充物 离子交换树脂基质 带电基团 洗脱剂 一定pH阳离子交换树脂与阴离子交换树脂 75 氨基酸与树脂的亲和力 取决于它们之间的静电吸引 和氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作用 层析下来的先后顺序为 F A L 76 77 图示 78 收集 氨基酸分析仪图解153页 79 氨基酸的制备和应用状况 1 氨基酸的制备从蛋白质水解液中分离提取应用发酵法生产应用酶的催化反应生成氨基酸有机合成法2 氨基酸的用途蛋白质的基本组成对生物体具有其他特殊的生理作用 参与许多代谢作用 不少已用来治疗疾病用于食品强化剂 调味剂 着色剂 甜味剂和增味剂用于饲料添加剂调节皮肤pH值和保护皮肤的功能 80 第二节蛋白质概述157页 蛋白质的化学组成与分类蛋白质的构象和结构蛋白质生物学功能 81 一 蛋白质化学组成与分类 化学组成特点蛋白质的分类 82 1 元素组成特点 蛋白质的含氮量接近于16 蛋白质系数 1克氮所代表的蛋白质质量 克数 6 25 蛋白质系数是凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础粗蛋白含量 样品含氮量 6 25蛋白质含量 样品蛋白氮 6 25有些还含有 e Cu Zn Mn等 83 三聚氰胺 是一种重要的氮杂环有机化工原料 主要用于生产三聚氰胺 甲醛树脂 广泛用于木材加工 塑料 涂料 造纸 纺织 皮革 电气 医药等行业 目前是重要的尿素后加工产品 此外三聚氰胺还可以作阻燃剂 减水剂 甲醛清洁剂等 动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖 泌尿系统的损害 膀胱 肾部结石 并可进一步诱发膀胱癌 84 2 蛋白质的分类 分类依据来源 理化性质 分子形状 化学组成 结构与功能等 常用的分类方法根据组成按分子形状 85 1 根据组成不同 158页 表4 1 4 2 单纯蛋白质结合蛋白质 亦称缀合蛋白质 非蛋白部分称为辅基 配体 辅基与多肽共价或非共价结合 86 2 蛋白质的形状和大小 纤维状蛋白质 轴比大于10 多不溶于水和稀盐溶液 球状蛋白质 轴比小于10 易溶于水膜蛋白质 不溶于水 但能溶于去污剂溶液 87 蛋白质的相对分子质量159页 表4 4 残基数目 链 单一链 两种链 三种链等 单体蛋白质 monomericprotein 寡聚 多聚 蛋白质 亚基之间非共价键结合 简单蛋白质的相对分子质量 110 氨基酸残基数 153个 88 3 根据营养价值分类 缺价蛋白质 不完全蛋白质 蛋白质中缺乏某个或某些必需氨基酸 完全蛋白质8种必需氨基酸都有的蛋白质 蛋白质互补作用 89 二 蛋白质的生物学功能160页 1 是生物体内重要的组成成分和结构成分2 功能的多