年产一百万株组培脱毒枣苗的工厂化设计.doc

年产一百万株组培脱毒枣苗的工厂化设计 姓名： 学号： 班级： 1项目背景1.1该植物的生物学知识、特性枣树属鼠李科（ Rhamnaceae ）枣属（ Zizyhu Mill ）植物，为落叶乔木，高可达10米，树冠呈卵形。枝有长枝、短枝与脱落性小枝之分。长枝红褐色，呈“之”字形弯曲，光滑，有托叶刺或不明显；短枝在二年生以上的长枝上互生；脱落性小枝较纤细，无芽，簇生于短枝上，秋后与叶俱落。树皮为灰褐色，条裂状。叶卵形至卵状长椭圆形，先端钝尖，边缘有细锯齿，基生三出脉，叶面有光泽，两面无毛。56月开花，聚伞花序腋生，花小，黄绿色。结核果，核果卵形至长圆形，89月果熟，熟时暗红色。果核坚硬，两端尖， 味甜。枣树适应性强 ，需水不多，适合生长在贫瘠的土壤，树生长慢，具有耐瘠薄抗盐碱、耐干旱 抗涝的能力 ，并且结果早 ，经济寿命长，易于管理 ，尤其枣树具有出芽期晚、开花期长的优越性，能够躲过西北地区规律性的风灾和降温天气，故有“铁杆庄稼”之称。 1.2该植物的经济价值、生产现状与市场前景枣果营养丰富，除含糖、蛋白质、脂肪等营养物质外，含有丰富的维生素C 、cAMP以及钙，其重要食疗成分的含量均居百果前茅,是名符其实的高营养果品。枣果鲜食制干兼宜, 除作为一般果品外，还是重要的节日用品、传统中药、滋补保健佳品以及烟用香精和食品加工的重要原料。可加工蜜枣、乌枣、南枣、醉枣、枣酒、枣泥、枣酱、枣汁、枣茶、滋补精、罐头、烟用香精、食用红色素、以及膳食纤维和cAMP糖浆等。 由于枣树的种仁率低，传统上的无性繁殖方式有分株、嫁接、扦插。分株是在枣树周围挖沟，切断根系，促进根蘖萌生的方法；嫁接一般是以酸枣等野生枣树的实生苗或根孽苗为砧木，以优质枣树品种生长健壮的13年生枣头一次枝或23年生二次枝为接穗，在树液流动时进行(4月上旬左右)；扦插是用长1416厘米带叶的当年萌发的半木质化的枝条，以500ppm的吲哚丁酸(IBA)或ABT生根粉水溶液处理插穗基部510秒后插入床中，一般从每年的5月中旬至8月中旬枣树新梢生长的季节进行。1 1.3该植物生产中存在的主要问题和解决途径枣苗传统的无性繁殖方法都存在着不可避免的一些缺陷：通过传统无性繁殖的苗木一般会携带一种至多种病毒或类病毒，另外，无性繁殖还会使病毒传代积累，长期会引起大量减产、品种退化等问题，严重时甚至树体枯死。此外，利用孽根分株不但会伤害母株而且可能导致品种的混杂；嫁接虽简单易行，成活率高，但发枝量少，树冠不易成型；扦插耗枝量大，必须是当年萌发的半木质化的枝条，不宜取材。利用植物组织培养技术生产枣苗不仅可以通过消毒克服病毒传代积累的问题，生产脱毒植株，还具有取材少，可迅速大量繁殖优质植株的优点。21.4本项目的必要性 综上所述，枣树以其独具特色的生长特性以及枣树果实营养价值，在我国目前除黑龙江、吉林、西藏外，北纬19-44度、东经76-124度的各个省区均有分布,其垂直分布在华北和西北的个别地区可达1300-1800m,在低纬度的云贵高原可达2000m。尤其近年来在西北地区的栽植面积日趋增长。产量上，枣树已经成为我国第七大果树树种，就栽培面积而言，是第一大干果。而传统的繁殖方式生产生物枣苗无法避免枣疯病等病毒类病害的感染，而且这类病害一旦被感染就无法治愈，严重威胁果农的经济效益，严重时还可引起枣林的大面积死亡，这是枣农种植枣树最担心的问题之一。本项目设计生产的组培脱毒枣苗不但可通过组培过程的消毒脱除母株所携带的病毒及类病毒，还因其取材少、繁殖快，可以在短时间内迅速生产出大量符合市场需要的优质植株，从而产生相当可观的经济效益。2本项目的主要内容和需要解决的关键问题2.1主要设计的内容本项目设计的工厂化育苗, 是利用前人研究成果，设计出一套在人工控制的最佳条件下, 采用科学化、标准化的措施, 高成活率、低成本、高生产效率的高质量脱毒枣苗的生产工艺流程，制定外植体消毒、培养基配制、无菌操作、褐变防治、诱导生根以及苗床炼苗等一系列操作流程，并对生产经费进行预算。2.2前人在枣苗组织培养方面已经取得研究成就2.2.1基本培养基的选择及激素配比 枣树组织培养多采用MS基本培养基。枣树属于慢生树种，适当降低 培养基中大量元素的含量，有利于枣树器官的分化。枣树外植体不同，适宜的培养基就不同，基因型是影响培养结果的内因：激素之间存在协同作用，当生长素细胞分裂素的比例高时有利于生根，生长素与细胞分裂素的比例低时有利于生芽，若两者浓度相当则有利于产生愈伤组织。 2.2.2试管苗的炼苗及移栽 在移栽前必须进行适应性炼苗，使幼苗生长环境与周围的环境逐渐与自然环境相似 ，以提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用能力和健壮度，从而提高移栽成活率。从试管苗到大田移栽，多数学者采用提高后期生根培养光照的方法，经过营养钵或蛭石苗床培养过渡到温室移栽，再过渡到大田移栽。但采用这种方法试管苗需道程序才能进入大田，投入成本高，移栽成活率要经过营养钵或蛭石苗床培养过度到温室移栽，再过渡到大田移栽。陈宗礼等研发的温室过渡法防污染炼苗和一步法移栽技术，培养优质试管生根苗，温室自然光过渡法炼苗，移栽地土壤，覆盖沙和试管苗根部消毒，沙土分层移栽，扣小棚保湿(85%95%)保温(1835 )，移栽初期适度遮阳，幼苗生出45片新叶后逐步揭小棚，移栽后加强病虫害防治及水肥管理.采用该配套移栽技术使组培枣苗的平均移栽成活率310月份达94.3%(92.8%95.8%,95%置信度),67月份达98%(96.1%99.9%)。42.2.3褐变的产生及抑制 褐变是组织中的酚类化合物被氧化生成棕褐色的醌类物质，进而使整个外植体组织受到伤害，甚至导致培养物死亡的现象。褐变在木本植物组织培养中尤为严重，其发生与外植体中所含的酚类化合物量和多酚氧化酶活性具有直接关系，其次还受到外植体基因型、培养。枣树组织培养基成分、培养条件等诸多因素的影响过程中，在愈伤组织的诱导、继代、分化培养中均有褐变现象的发生。通常采用暗处理710d ，连续转移，并在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂的方法来抑制褐变，该方法具有明显效果。2.2.4污染的产生及对策 污染在枣树组织培养过程中经常发生，造成污染的病原菌主要可分为细菌和真菌两大类。真菌性污染主要指霉菌引起的污染，该类污染可通过完善操作规程、改善培养环境、严格操作程序等措施来克服；细菌性污染的主要症状是培养材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物质，或在培养材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。细菌性污染除由操作不当造成之外，主要由外植体带菌引起，情况较为复杂，与外植体的种类、取材季节、部位、预处理方法及消毒程序等密切相关。在枣树的组织培养中，可采用组培苗、水培芽、黄化枝条等材料作为外植体，以减少细菌的污染 ；对于材料内部带菌的组织，可以在培养基中加入适量抗生素予以克服。2.2.5枣疯病病原体的脱除枣疯病又称丛枝病、公枣病，是一种毁灭性病害，其病原菌为植原体，广泛存在于寄主的筛管和伴胞中，通过嫁接、根蘖苗分株和传病昆虫等途径传播。枣树感染枣疯病病菌后，内源激素平衡失调，生理代谢紊乱，主要表现为叶片黄化、小枝丛生、花器返祖、果实畸形等症状；按不同发育阶段，症状表现为花叶、花变叶和丛枝三种类型 。 利用组织培养技术脱除枣疯病植原体，可采用以下3种途径：（1）热处理与茎尖分生组织培养相结合。以枣树小于0.7mm的茎尖为外植体，成功脱除了枣疯病病原菌 。但该方法操作难度高，茎尖成活率低，难以成功建立无性系；（2）愈伤组织培养再生植株。以枣树叶片离体培养再生植株，得到不带枣疯病病原菌的脱毒苗 。但该途径培养过程中枣树变异性大，对优质良种枣树的脱毒快繁不利；（3）用1年生硬枝湿热脱毒结合高温培养脱毒，此法是目前优选的一条脱毒途径。2.3项目的关键技术本项目脱毒枣苗的工厂化设计技术包括培养材料的选择消毒、培养基的制备灭菌、组培苗快速繁殖、生根、炼苗移栽和成苗管理六个阶段3 。其中关键技术有：外植体的消毒、培养基消毒及组培过程中的消毒技术，防止组培苗褐化及玻璃化植株产生，试管苗的训化技术。 2.4 设计的工艺路线3洗涤间：洗瓶及玻璃仪器配药间：培养、配制、分装消毒间：培养基及其他物品消毒培养基配制 粉碎土壤、调配基质及装填容器组培苗炼苗及移栽移栽容器幼苗管理接种与培养接种室：无菌操作、组培苗转接培养室：组培苗继代培养、增殖和生根培养组培苗移栽商品试管苗商品容器苗苗木喷淋及水肥管理苗木分级、销售小苗培育商品大苗3项目所需要条件3.1主要建筑设施培养基制备室（洗涤间，配药间，消毒间,60平方米）；操作室（预备间，操作间）；培养室（具备先进的光控，温控等设备）；大棚（炼苗移栽）。3.2需要的各种设备和仪器 设备名称数量总价（万元）电子天平20.4全自动高压灭菌锅（500L）14培养架301超净工作台52.5电冰箱20.6鼓风电热干燥箱20.3洗瓶机13分装机10.78空调机（冷暖型）31.5蒸馏水发生器10.38药品柜台61.2培养瓶20000020酸度计20.6合计：36.26万元3.3药品试剂和耗材 3.3.1药品 MS培养基成份分类化合物20L培养基用量（g）100万株用量（kg）大量元素母液NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO433388.87.43.4165190443717微量元素母液FeSO47H2ONa2EDTAMnSO44H2OZnSO47H2OCoCl6H2OCuSO45H2ONaMoO42H2OKIH3BO30.5560.7460.4460.1720.00050.00050.0050.01660.1242.783.732.230.860.00250.0250.0830.62维生素母液烟酸（VB3）盐酸吡哆素（VB6）盐酸硫胺素（VB1）0.010.010.0080.050.050.04氨基酸母液甘氨酸0.040.2肌醇母液肌醇210注：按每株枣苗需100ml培养基计其他药品：生长素、细胞分裂素、赤霉素、吲哚乙酸。3.3.2耗材：活性炭、医用解剖刀、橡胶手套、酒精灯、紫外灯。4设计的技术规程4.1 设计的工艺技术的原理4.1.1外植体的选择及消毒 外植体选择枣树的茎尖组织。虽然枣树的许多组织，如胚轴、叶片5,6的组培实验均已成功，但是茎尖由于其分生速度快，还未被母体植株所携带的病毒感染，所以是工厂化生产组培苗木的理想外植体来源。 组培枣树茎尖消毒,其灭菌时间可以采用7O酒精10S十01升汞5min， 成活率较高。托叶及残留叶柄的真菌污染率很高，在前处理阶段把托叶及残留叶柄去掉，可有效降低污染率7。4.1.2褐化及玻璃化的防治预防褐化可采用吸附剂如活性炭( 0 . 1%0. 5% )，活性炭可吸附培养基内的有毒物质，从而预防褐化8。 预防玻璃化(1) 利用固体培养基, 适当增加琼脂浓度,可阻遏细胞吸水过度。同时尽可能使用高纯度的琼脂。(2) 适当增加培养基中蔗糖的含量, 降低培养基的渗透势,可阻遏外植体过量吸收水分, 造成水分胁迫。(3) 增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu 等元素含量、降低N 和Cl 元素比例, 尤其是降低铵态氮含量, 提高硝态氮含量。大多数植物在MS 培养基上生长良好, 玻璃化苗的形成较少, 主要是由于MS 培养基中所含的各种矿物质离子的数量、形态和离子间的比例比较平衡。(4) 增加自然光照。 许多植物的玻璃化苗放于自然光下几天后, 茎、叶变红, 玻璃化逐渐消失, 原因是自然光中的紫外线等能促进试管苗成熟、加快木质化8。4.1.3试管苗的驯化 具体做法是提前3-4d将要炼苗的试管苗放在温室中进行驯化以适应环境，然后取出试管苗，洗去根部的培养基进泡于杀菌剂中8-10min,栽于消过毒的基质中。4.2 设计的技术操作方法与规程4.2.1外植体的选择(1) 选择优良的种质：选取正在推广的优良品种或具有经济潜力的优质品种。 (2)选择健壮的植株：挑选优良品种的健壮植株作为外植体。 (3)选取大小适宜的材料：材料太大易污染，也没有必要；材料太小，多 形成愈伤组织，甚至难于成活。培养材料的大小一般在0.50.7cm之间。 4.2.2外植体的灭菌、接种4.2.2.1灭菌外植体在接种前必须灭菌。在灭菌前，先在准备室对外植体进行预处理，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此拿入接种室后还需进一步灭菌。 常规的表面灭菌处理方法是把材料放进70%的酒精中，约30s后用无菌水冲洗1次，再在0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡510min，或在10%的漂白粉澄清液中浸泡1015min，然后用无菌水冲洗35次。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 4.2.2.2接种接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。（1）接种室用紫外灯照射灭菌2030 min，或提前0.51天用高锰酸钾和甲醛混合液薰蒸。接种台要提前开启。（2）工作人员进入接种室前需用肥皂水洗手灭菌，并在缓冲室换上已经灭菌的白色工作服和拖鞋，戴工作帽和口罩。工作人员的呼吸也是污染的主要途径，通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，头皮屑也带有细菌，因此操作过程应禁止不必要的谈话，并戴上帽子和口罩。（3）进入接种室后用70%的酒精擦洗双手、接种台和一切需放上工作台的所有器具，对外植体进行灭菌处理。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。（4）点燃酒精灯，将接种钩、剪刀、镊子放入不锈钢盘或瓷盘内烧灼，冷却后备用。接种钩、剪刀、镊子等不使用时浸泡在95%酒精中，用时在火焰上灭菌，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具灭菌。（5）将外植体放入经烧灼灭菌的不锈钢盘或瓷盘内处理。如外植体为茎段的，将茎段上的叶柄和茎的上下端剪掉一小节；培养脱毒苗的，在双筒解剖镜下剥离切取大小约0.20.3 mm的茎尖分生组织。（6）烧灼瓶口和塞子，将培养瓶倾斜拿稳，打开塞子，用镊子将接种材料送入瓶内，用接种钩将材料压入培养基中，烧灼瓶口和塞子并上塞。在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，烧灼是解决这个问题的有效办法。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。4.2.2.3外植体的培养接种后的外植体应送到培养室去培养。培养过程中既要调控好培养条件，又要注意防止发生菌类污染、外植体褐变和植株玻璃化现象，确保组织培养的成功。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气等。（1）光照 光照对离体培养物的生长发育具有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导来说，暗培养比光培养更合适。但器官的分化需要光照，并且随着试管苗的生长，光照强度需要不断地加强，才能使小苗生长健壮，并促进它从“异养”向“自养”转化，提高移植后的成活率。一般先暗培养1周，1 周后每日光照1012h，光照强度从10003000lx逐渐过渡。暗培养可用铝箔或者适合的黑色材料（如黑色棉布）包裹在容器的周围，或置于大纸箱和暗室中培养。 （2）温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度。培养室温度一般保持在252。低于15或高于35，对生长都是不利的。 （3）湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%；二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。培养室湿度过高过低都是不利的，过低可能造成培养基失水而干枯或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，培养某些耗氧多的植物，采用通气性好的瓶盖、瓶塞或透气膜封口的，要求室内保持70%80%的相对湿度。湿度过高时可用除湿机降湿，过低时可用喷水来增加湿度。（4）氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的有效办法。在固体培养中，对于某些耗氧多的植物要采用通气性好的瓶盖、瓶塞，或用透气膜封口。对于耗氧少的植物，组织培养中培养瓶内能维持正常的氧气和二氧化碳循环，用密封性好的封口材料更能有效地防止菌类污染。4.2.2.4芽的增殖和根的诱导（1）芽的增殖外植体经初代培养诱导出不带菌的无菌芽。为了满足规模生产的需要，当试管苗长到7-8片叶时，必须通过不断的继代培养，使无菌芽大量增殖，培养出成千上万的无菌芽。继代培养所用培养基可与初代培养基相同，也可根据可能出现的情况，逐渐地适量降低细胞分裂素的浓度，调整无机养分比例，或加入活性炭等，以防出现玻璃化或褐化现象。继代培养的接种过程与初代培养有两点不同，一是不需要对接种材料进行灭菌处理；二是在空间较大的培养瓶中接种，接种更方便。接种时，先将外植体上的无菌芽剪下，或将已继代过的丛状无菌芽分开。较长的无菌芽可剪成几段接种，但必须保证每一段上至少有一个节。接着用镊子将剪好的接种材料放入培养瓶中，再用接种钩拨动使材料在瓶中均匀分布，最后将接种材料的下端压入培养基中。除此以外，断代培养的接种过程和要求与初代培养相同，同样必须确保无菌操作。 继代培养期间培养室环境条件的控制，除了不需要暗培养外，光照、温度、湿度和通气条件的控制与初代培养基本相同。要注意根据继代苗出现的情况，调节光照、温度、湿度和通气条件，或及时转入新的培养基中培养，防止产生褐化现象和玻璃化现象。（2）根的诱导 与继代培养基和初代培养基相比，生根培养基有个三特点。无机盐浓度较低。一般认为，矿质元素浓度高时有利于发展茎叶，较低时有利于生根，所以生根培养时一般选用无机盐浓度较低的培养基配方。用无机盐浓度较高的培养基配方时，应稀释一定的倍数。如使用MS培养基，在生根诱导培养中多采用1/2MS或1/4MS。细胞分裂素少或无。生根培养基一般要完全去除或仅用很低浓度的细胞分裂素，并加入适量的生长素，最常用的生长素是NAA。糖浓度较低。在生根阶段，培养基中的糖浓度要降低到1.01.5%，以促进植株增强自养能力，有利于完整植株的形成和生长。 4.2.2.5组培苗的炼苗与移栽 (1)组培苗的炼苗炼苗即驯化，目的在于提高组培苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使组培苗健壮，最终达到提高组培苗移栽成活率的目的。驯化应从温度、湿度、光照及有无菌等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。驯化的方法是将长有完整组培苗的试管或三角瓶由培养室转移到半遮荫的自然光下，并打开瓶盖注入少量自来水，使组培苗周围的环境逐步与自然环境相似，恢复植物体内叶绿体的光合作用能力，提高适应能力。驯化一般进行35周。（2）组培苗的移栽 炼苗后将苗木取出，洗去培养基，移栽到无菌的混合土中，保持一定的温度