电镜复习材料.doc

第1章 概述1、电子显微镜的发展德国人Ruska 1938年制造出一台真正实用的电子显微镜，其分辨率为10nm，比光镜提高了20倍。由于Ruska在电子显微镜方面作出的巨大贡献，他被誉为电子显微镜之父。2、电子显微镜发展的理论基础 Broglie的粒子波动性理论Busch的电磁场对电子具有会聚作用的理论3、电子显微镜的类型（知道，了解）透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）扫描透射电镜（scanning electron microscope, STEM） 分析电子显微镜（analysis electron microscope, AEM） 高压电子显微镜（high voltage electron, HVEM） 扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）原子力显微镜（atomic force microscope，AFM） 第二章 电子显微镜的基本理论1、分辨率 和有效放大倍数 的关系 M有=人眼/仪 2、 影响分辨率 的因素 为照明光的波长；a为孔径角的一半，n为透镜和样品之间介质的折射率。其中n。Sina称为数值孔径。3、 电子束的特性：电子束是由带负电荷的电子组成的一种阴极射线流，高速运动的电子也具有粒子性和波动性。 电子束的波动性和可折射性是构成电镜的理论基础。4、电子波的波长 和加速电压 、分辨率的关系加速电压越高，电子波的波长越短。电子波的波长越高，分辨率越高。5、 电子束与样品的相互作用 ：电子束轰击样品时，与样品物质原子及核外电子发生弹性或非弹性散射作用，产生带有样品信息的各种电子讯号。电子束与样品的相互作用是电子在样品中运动、扩散、激发以及能量传递的复杂的物理过程。 电子束和样品相互作用后产生的各种信息：透射电子（TE） 、 二次电子（SE）、 背散射电子（BE） 、俄歇电子（AE）、 X射线 等电子信号透射电子：根据透射电子所带的样品信息转换成图像二次电子：可以反映样品表面的形貌，是扫描电镜成像的基础背散射电子：可以反映样品的表面形貌和成分的差异。背散射电子信号转换成图像的分辨率低于二次电子的图像。俄歇电子：利用俄歇电子进行分析的俄歇电子谱仪适用于超轻元素的分析。X射线：可以用于对样品进行定性或定量分析。6、电子显微镜的优点：很高的分辨本领：放大倍数高，放大倍数从几十倍到几十万倍之间可连续变倍。第3章 透射电子显微镜1、透射电子显微镜的结构 电子光学系统（镜筒）、真空系统 和电子学系统 电子光学系统的组成和作用 ： 1、 照明系统（ 电子枪、 聚光镜等）：由电子枪发射电子束，经聚光镜汇聚后照射样品。 2、样品室：样品室是承载和移动样品的装置，位于聚光镜之下，物镜之上。样品室还装有气锁装置，以便于在不破坏镜筒真空度的情况下更换样品。 3、 成像放大系统（ 物镜、物镜光栏、 中间镜、 投影镜等）：作用是将电子束照射样品后产生的样品信息由物镜作第一次放大，再由中间镜、投影镜进行多级放大，通过改变各个透镜的激励电流，可以获得不同工作模式和放大倍数。 4、观察记录系统 （ 观察室 、 照像装置、 CCD等）2、透射电子显微镜的工作原理 成像原理：图像的反差主要有振幅反差（散射吸收差）、相位反差、衍射反差等，其中由吸收散射电子形成的振幅反差在透镜成像中起着主要的作用。 工作原理：电子枪产生高能电子束 聚光镜控制光斑的大小和亮度 电子轰击样品 物镜聚焦透射电子 中间镜和投影镜放大 在荧光屏上将电子信号转成可见光形成图象3、提高生物样品图像反差的方法（5种） 1）用重金属盐来染色，以增加样品某些结构的质量厚度。 2）用重金属投影喷渡。 3）在电镜观察中使用物镜光阑可以提高图像的反差，物镜光阑越小，图像反差越强。 4）降低加速电压，因为电子的散射角度的大小与加速电压的平方成反比关系，降低电子加速电压可以提高图像的反差。 5）利用暗场显微方法。 6）样品切片厚度对图像反差的影响。通常，在保证一定分辨率的情况下，选择适当后的切片，可以增加图像的反差。第5章 超薄切片技术1、超薄切片制样的一般程序如下：取材醛类固定 2小时以上缓冲液清洗 30分钟锇酸固定 23小时缓冲液清洗 30分钟梯度脱水 81030分钟环氧丙烷置换 30分钟浸渍 10小时以上包埋Epon812聚合（60C） 48小时修块和超薄切片铀染色 1545分钟铅染色 1545分钟 2、取材的原则和基本要求1、取材部位要准确2、取材要迅速3、取材时的温度4、材料的体积要小5、取材时避免损伤6、实验对照组3、常用固定剂种类及其性能-醛类、锇酸、高锰酸钾 醛类（戊二醛、甲醛、多聚甲醛）：穿透性强，固定迅速，不易使酶失去活性，在低温条件下，用醛类固定的样品可长期保存，样品不会变脆、变黑。其缺点是对脂质不起固定作用，没有电子染色作用。锇酸：锇酸对氮基、肽、蛋白质、不饱和脂肪酸、脂蛋白和核蛋白有良好的固定作用，在对样品固定的同时兼有电子染色作用。但是锇酸对DNA、RNA、糖元和微管等没有固定作用，而且对酶的活性的影响很大。高锰酸钾：是一种强氧化剂，对磷脂蛋白有很好的固定作用。特别适用于神经髓鞘、叶绿体以及细胞器膜结构的固定。对其他细胞成分的固定效果很差。4、 固定过程中需要注意的问题1） 固定液的PH值：其PH值必须接近所需固定组织液的PH值2） 固定液的浓度：一般戊二醛的浓度为2-3，锇酸的浓度为1-2，根据组织材料的含水量来选择适当的浓度。3） 固定液的渗透压和离子组成。一般来讲，低渗的固定液容易引起组织的肿胀，高渗的固定液容易引起组织的收缩。4） 固定的温度和时间。固定的温度一般在0-4度范围内，这样可以降低酶的活性，减少自溶。5） 固定材料的大小。过大的样品会造成样品中央部分固定不足，通常样品大小约为1mm3。5、电子染色剂的种类及其特性 -醋酸铀 、柠檬酸铅 醋酸铀：作为染色剂可以提高核酸、蛋白质和结缔组织的反差，但对膜的染色效果较差。 柠檬酸铅：铅盐染色剂其密度大，对各种细胞结构都具有广泛的亲和作用，特别是对提高细胞膜系统和脂类物质的反差有明显的效果。铅类染色剂增加反差的能力比铀类染色剂要大。是使用柠檬酸盐和阳离子的碱性铅形成稳定的络合物。第六章 负染色技术1、负染色： 通过重金属盐在样品四周的堆积提高样品外围的电子密度，衬托出样品的形态和大小。由于在电镜观察时，生物结构部分为透亮的，图像为负片，故称负染色 。2、负染色技术特点：具有分辨率高（可达20A）、简单方便、快速的优点3、负染色剂具有不同的染色特性 -磷钨酸（PTA） 、醋酸铀 等 磷钨酸：是最常用的负染色剂。具有颗粒细腻，反差良好，图像背景干净，杂质少的优点。但显示样品的细微结构较差，对某些病毒样品有破坏作用。 醋酸铀：能较好的显示病毒颗粒结构的细节，反差较强，对样品的破坏作用小。其缺点是含有较多的细小颗粒性杂质，使用前最好过滤处理。4、负染色的操作方法 -悬滴法 、漂浮法、喷雾法 悬滴法：先用毛细血管吸取样品悬浮液，滴在有支持膜的铜网上，停留片刻后，用滤纸从铜网的边缘缓慢的吸去多余的液体，待铜网上的液膜将干未干时，滴上负染液，染色0.5-2分钟，再用滤纸吸去多余的染液。漂浮法：将样品悬液滴在干净的蜡盘上，用有支持膜的铜网，膜面向下漂浮于液滴上，吸附样品后，用滤纸吸去铜网上多余的液体，在铜网上的液膜未干时，用染色剂进行滴染或漂浮染色。喷雾法：将样品与染液混合，用特制的喷雾器将混合液喷洒在有膜的铜网上即可。5、 影响负染色效果的主要因素 （5点） 1）样品的凝集问题 2）样品的浓度和纯度 3）样品悬液和负染色的酸碱度 4）染色操作方法的影响 5）镜检操作观察第7章 金属投影技术1、金属投影技术的特点。 主要用于微颗粒状生物样品如：细菌、病毒、噬菌体、原生动物、孢子、蛋白质分子、核酸分子以及其他各种非生物的微粒和粉末状材料。由于采用金属投影技术制样获得的图像的分辨率不高，对于一些像病毒等极小微粒的制样，目前常使用负染色技术。有一些不适宜作负染色的样品，采用金属投影来增加反差仍然是唯一的途径。第8章 电子显微镜的冷冻制样技术1、冷冻制样技术是利用低温冷冻方法处理样品的物理制样技术2、冷冻制样技术的优点和缺陷。优点：1）利用物理低温固定取代化学固定，能使生物样品保持含水时的状态 2）减少细胞内物质的抽提。 3）更好的保持组织或细胞内生物大分子、酶和其他化学成分的自然结构和特性 4）避免化学试剂的使用 5）操作步骤少，时间短，适用于快速研究与诊断缺点：1）操作技术难度较大 2）冰晶损伤会影响组织的超微结构3、 冷冻制样技术包括 ：冷冻真空干燥技术冷冻取代技术冷冻超薄切片技术冷冻断裂蚀刻复型技术4、 冷冻剂冷冻剂均具有较低的冰点：丙烷、异戊烷、氟星昂12、氟星昂22、液氮、液氦5、 冷冻保护剂 及作用 1）穿透性冷冻保护剂：利用防冻剂与细胞内的水分结合，从而减少样品中的水分，缩小冷冻点与再结晶点的温度差，避免冰晶的形成，达到冷冻保护作用。有20-50的甘油，0.6-1.6M浓度的葡萄糖或蔗糖 2）非穿透性冷冻保护剂：常用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或羟乙基淀粉（HES），他们能很好的保存组织的形态，免受冷冻损伤，同时对组织的生理功能造成的扰动最小，适合用于组织的X射线显微分析。第9章 扫描电子显微镜的结构、原理和使用1、 扫描电镜的电子光学系统扫描电镜的电子光学系统由电子枪、灯丝对中（合轴）线圈、聚光镜、扫描（偏转）线圈、物镜及其光阑、消像散器和样品室等组成。它的作用是产生具有较强的亮度和尽可能小的束斑直径的电子束，通过电子束以扫描方式照射样品，激发样品产生电信号。扫描电镜的电子光学系统与透射电镜相比，其特点是：（1）扫描电镜是用来聚集电子束，形成电子探针 （2）电子束在样品上作很有规律的扫描运动 （3）样品室的结构特殊，样品可以作多维的运动2、扫描电镜的工作原理流程1、电子枪发射高能电子束聚光镜会聚，2、形成电子探针在偏转线圈作用下，3、电子探针作x、y扫描运动在物镜作用下，4、电子探针聚焦于样品表面电子探针逐点照射样品，5、产生连续的电子信号信号检测器收集、放大，6、将电子信号转换成电信号视频放大，在显像管上形成图像3、扫描电镜图像形成的基本原理 电子束扫描照射样品时会产生反映样品特征或特性的各种信息（如二次电子、背散射电子、透射电子、吸收电子），使用不同的检测器分别捕获这些信息，形成不同的图像，可以从不同的角度研究样品的特性。二次电子（SE）图像的形成几种效应1、倾斜角效应 2、边缘效应与尖端效应 3、原子序数效应和组分效应 4、加速电压效应 5、充放电效应 背散射电子（BSE）图象的特点：表现样品表面特征的同时可以反映样品元素成分的差异。第10章 扫描电镜生物样品制备技术1、扫描电镜生物样品制备的基本要求1样品观察表面必须真实2样品必须干燥且不变形3样品观察表面必须具有良好的导电性和较高的二次电子发射率2、扫描电镜生物样品制备的基本方法取样 -清洗- 固定- 脱水- 置换 - 干燥 - 粘样- 镀膜 3、 镀膜的作用 1）增加样品表面和样品之间导电性，以防止或减轻充放电效应 2）减少电子书对样品的损伤 3）增强二次电子发射率，提高图像的亮度和反差，提高分辨能力 4）把二次电子信号来源限定在样品的表面，防止来自样品内部的信号混入，使图像更加真实4、 干燥的方法自然干燥法、真空干燥法、冷冻真空干燥法、化学真空干燥法、临界点干燥法5、 样品导电处理的方法表面镀膜法：1）真空镀膜法 2）离子溅射镀膜法 组织导电技术（TCT法）第十一章 电子显微镜的细胞化学技术（了解）1、酶细胞化学的电镜技术按其反应原理大体分为： 1）金属盐法 2）四唑盐法 3）二氨基联苯胺（DAB）法2、 无机离子的细胞化学技术（了解） 选用某种重金属离子与组织细胞中的无机离子发生特异性沉淀反应，在电镜下显示出该离子的存在部位，进行准确的定位。所选的重金属离子必须能够很快的穿透组织，与所要检测的无机离子迅速结合，产生电子致密的沉淀，以免离子发生位移。 1）钙离子的定位 2）磷酸盐离子的定位 3）重金属离子的定位 第十二章 免疫电子显微镜技术1、胶体金标记免疫技术：用胶体金标记抗体检测细菌表面抗原 特点：1）制备简单 2）标记简单 3）特异性强 4）敏感性高 5）可进行双重和多重标记 6）适应范围广2、 固定剂、缓冲液 、包埋剂的选择第13章 电镜的放射自显影技术第14章 电子显微镜x射线微区分析技术 是借助于样品发出的元素特征X射线的波长或能量，在超微结构水平上对试样形态研究的同时，测定试样所含有的元素（定性分析），以及测定各元素特征X射线的强度，进行定量分析。1、制样方法 1）对于