第五章 分子发光分析法(讲义).ppt

第五章分子发光分析法 Molecularluminescenceanalysis 5 1概述 5 2荧光分析法 5 3磷光分析法 5 4化学发光分析法 基态分子吸收了一定能量后 跃迁至激发态 当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 便产生分子发光 化学发光Chemiluminescence 场致发光 热致发光 光致发光Photoluminescent 磷光Phosphorescence 荧光Fluorescence 5 1荧光分析法分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性 以荧光强度进行定量的一种分析方法 一 基本原理 一 分子荧光 磷光 的产生 室温下 大多数分子处在基态的最低振动能层 处于基态的分子吸收能量 电能 热能 化学能或光能 后被激发为激发态 激发态不稳定 将很快衰变到基态 若返回到基态时伴随着光子的辐射 这种现象称为 发光 单重态 激发单重态 三重态 去活化过程 处于激发态的分子是不稳定的 它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基态 由较高能态到较低能态的过程 其中 以速度最快 激发态寿命最短的途径占优势 去活化过程 振动驰豫 VR 在同一能级中 分子由较高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁 其速率极大 10 14 10 12s内即可完成 内转换 ic 指相同多重态的两个电子态之间 S2S1 S1S0 的非辐射跃迁 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时 常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级 如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层相重叠 分子无论在哪一个激发单重态 都能通过振动驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级 1 2 3 1 2 2 VR 1 VR ic isc F P 3 体系间窜跃 isc 指不同多重态的两个电子之间的非辐射跃迁 它涉及受激发电子自旋状态的改变 如S1T1 使原来两个自旋配对的电子不再配对 这种跃迁是禁阻跃迁 含有重原子 碘 溴等 的分子中 体系间跨越跃迁最为常见 在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体系间跨越的发生 因而使荧光减弱 4 荧光发射 Fluorescence 当分子处于单重激发态的最低振动能级时 去活化过程的一种形式是以10 9 10 6s左右的短时间发射一个光子返回基态 这一过程称为荧光发射 单重 单重 停10 9 10 6s 发射荧光的能量比分子所吸收的能量要小 即荧光的特征波长比它所吸收的特征波长要长 注意 基态中也有振动驰豫跃迁 3 1或 2 不论电子开始被激发至什么高能级 最终将只发射出波长为 3的荧光 5 磷光发射 Phosphorescence 从单重态到三重态的分子体系间窜跃发生后 接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低能层上 此时可能由两种途径返回基态 体系间窜跃 在10 4 10s左右时间内辐射跃迁回基态而发生磷光 这种跃迁所发射的光 在光照停止后 仍可持续一段时间 三重 单重 停10 4 10s 液氮冷冻试样 才可见磷光 荧光和磷光的根本区别 荧光是由单重 单重跃迁引起的 磷光则由三重 单重跃迁产生的 观察磷光现象时 试样要用液氮冷冻a 三重态与基态之间的能量差要比最低激发态和基态之间的能量差小 这使三重态与基态之间的振动偶合增强 因而增强了内部转换 b 激发三重态的寿命比激发单重态的寿命长 因而同溶剂分子碰撞而失去激发能的可能性增大 以致在室温条件下不能观察到溶液的磷光 因此 观察磷光现象时 试样要用液氮冷冻以使碰撞去活化和振动偶合去活化降至最低限度 1 2 3 1 2 2 VR 1 VR ic isc F P 二 荧光的激发光谱和发射光谱1 激发光谱 荧光和磷光都是光致发光 因此必须选择合适的激发光波长 这可从他们的激发光谱曲线来确定以荧光 磷光 的最大发射波长为测量波长 改变激发光的波长 测量荧光强度的变化 以激发光波长为横座标 荧光强度为纵座标作图 即可得到激发光谱 相对强度 萘的激发光谱 荧光光谱 磷光光谱 相对强度 荧光或磷光光谱曲线 固定激发光波长为其最大激发波长 然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度 将荧光的光波长为横座标 荧光强度为纵座标作图便可得到荧光光谱 发射光谱 2 激发光谱和荧光光谱的特点 1 荧光光谱的形状与激发光波长无关荧光物质吸收不同波长的激发光可被激发到不同能态 通过振动驰豫和内部转换最终都将达到第一激发单重态的最低振动能级 然后再发射荧光 故蒽的激发光谱虽在250nm和350nm有两个峰 不论用哪一个峰的波长作激发光源 所得荧光光谱的形状和峰的位置都是相同的 2 荧光光谱和激发光谱成镜像关系从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成镜像对称a 荧光光谱 发射光谱 形状与基态S0振动能级的分布情况 即能量间隔情况 有关b 激发光谱 吸收谱 形状与激发态S1振动能级的分布有关 c S0 S1态中振动能级的分布是相似的 说明峰形状相似 d 根据Frankcondon原理 电子跃迁过程中核的相对位置不变 近似的 若吸收光谱中某一振动带的跃迁几率最大 则在荧光发射光谱中 其相反跃迁的几率也应最大 说明高峰对高峰 低峰对低峰 非镜像对称的峰出现 则表示有散射光或杂质存在 3 荧光光谱波长 em大于激发光谱波长 ex斯托克斯 Stokes 于1852年首次观察到荧光光谱波长 em大于激发光谱波长 ex这一现象 称斯托克斯位移 它说明激发与发射间有一定能量损失 产生的主要原因是激发态分子发射前后都存在振动弛豫现象 例 区别谱图中的三个峰 说明判断原则 三 荧光效率及其影响因素 1 分子产生荧光必须具备的条件 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构 才能吸收激发光 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后 必须具有一定的荧光量子产率 荧光效率 荧光效率 荧光效率越高 辐射跃迁概率就越大 物质发射的荧光也就越强 荧光效率也可用各种跃迁的速率常数来表示 Kf 表示荧光发射过程的速率常数 主要取决于物质的化学结构 表示非辐射跃迁的速率常数之和 主要取决于化学环境 同时也与化学结构有关 2 荧光效率 3 荧光效率的影响因素 分子结构 a 跃迁类型 实验表明 大多数荧光化合物都是由 或n 跃迁激发 然后经过VR或其它无辐射跃迁 再发生 或 n跃迁而产生荧光 其中 跃迁的荧光效率较高 原因 的 较大 比n 大100 1000倍 其次 寿命约10 7 10 9s 比n 寿命10 5 10 7s短 此外 在 过程中 体系间窜跃至三重态的速率常数也较小 这都有利于荧光的发射 b 共轭效应 含有 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强 这种体系中的 电子共轭度越大 则 电子的离域性越强 越易被激发而产生荧光 而且荧光光谱将向长波移动 所以绝大多数能发生荧光的物质含有芳香环或杂环 对苯基化 间苯基化和乙烯化作用都将增加苯的荧光强度 并使荧光光谱红移 c 刚性平面结构 此结构可以减少分子的振动 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小 也就减少了碰撞去活的可能性 有利于荧光的产生 例1 荧光素有很强荧光 但酚酞无 是由于荧光素的刚性可减少分子振动 例2 芴和联苯在同样条件下的荧光效率约为1 0和0 2 芴上的亚甲基增强了分子的刚性 此外 当荧光染料吸附在固体表面上时 常使荧光发射增强 这可用固体表面诱导了分子结构的附加刚性来说明 例3 刚性的影响可说明螯合剂同M螯合时荧光增强的现象 滂铬兰黑R BBR 无荧光 它与铝形成螯合物有荧光 d 取代基效应 给电子取代基使共轭体系增大 使荧光增强 如 OH NH2 NR2 OR CN 吸电子取代基使荧光减弱甚至会猝灭荧光 如 COOH NO NO2 C O 卤素离子等 同 电子体系相互作用小的取代基 SO3H NH3 和烷基 对分子发光影响小 重原子效应 将一高原子序数的原子引入到 电子体系中去 往往会使物质的荧光减弱 而磷光增强 重原子效应 若使用含重原子的溶剂 也会发生外部重原子效应 导致磷光增强和荧光减弱 如卤素取代基荧光的相对强度氟代苯10氯代苯7溴代苯5碘代苯0原因 因为在原子序数高的原子中 电子自旋和轨道运动间的相互作用变大 更有利于电子自旋的改变 增大了体系间窜跃 而使荧光减弱 磷光增强 环境因素 A 溶剂的极性 极性增加 对激发态会产生更大的稳定作用 结果使物质的荧光波长红移 荧光强度增大 B 温度 辐射跃迁的速率基本不随温度而变 非辐射跃迁的速率随温度升高而显著地增大 因此 升高温度会使非辐射跃迁概率增大 荧光效率降低 C pH值 影响酸性 碱性取代基团的存在型体 应严格控制pH 如苯胺在pH 7 12时以分子型体存在 发兰色荧光 而pH小于2 pH大于13时以离子形式存在 不发生荧光 D 表面活性剂 增大荧光效率E 顺磁性物质 减小荧光效率如O2 四 荧光强度同浓度的关系1 荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率 If Ia据Beer定律 Ia I0 It I0 1 10 A 代入上式得 If I0 1 10 A I0 1 10 bc 若溶液很稀 A 0 05 则可近似为If 2 3 I0 bc对于一给定的物质 当激发光波长和强度一定时 荧光强度只与溶液浓度有关 If Kc荧光强度与荧光物质的浓度成正比 2 高浓度偏离线性关系的因素 a 当浓度较浓 不满足A 0 05 公式近似处理误差大 如果a 104 b 1 0代入abc 0 05得c 5 0 10 6mol L b 自猝灭 Self quenching 由荧光分子间以及荧光分子同溶剂分子间的碰撞产生的 c 自猝灭 c 自吸收 Self absorption 发生在荧光发射波长同化合物的吸收峰重迭的情况下 当荧光通过溶液时便被吸收一部分 3 影响荧光强度的因素 内滤光作用和自吸收现象 溶液中若存在着能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质 就会使荧光减弱 荧光物质的荧光发射光谱的短波长一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠 在溶液浓度较大时 一部分荧光发射被自身吸收 产生 自吸收 现象而降低了溶液的荧光强度 荧光猝灭 荧光熄灭 广义的说 指任何可使物质荧光强度下降的作用 任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用 或任何可使荧光量子产率降低的作用 狭义的说 指荧光分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程 荧光猝灭剂 与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质 1 动态猝灭猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生的相互作用过程 能量转移过程等 可生成瞬时激发态复合物 不发射荧光 或荧光的发射特性与原先的荧光物质不同 从而引起荧光猝灭现象 动态猝灭的效率受荧光物质激发态分子的寿命和猝灭剂的浓度限制 1 萘胺的荧光在碱性溶液中发生猝灭现象 但它的吸收光谱并无变化 这是动态猝灭的一个例子 2 静态猝灭猝灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合反应 降低了荧光物质的荧光强度 动态猝灭中的荧光量子产率由光反应动力学控制 静态猝灭中的荧光量子产率只受基态的配位作用的热力学所控制 3 猝灭剂氧能使多数荧光物质产生不同程度的荧光猝灭现象 胺类是大多数未取代的芳烃的有效猝灭剂 卤素化合物 重金属离子以及硝基化合物等 也是常见的猝灭剂 卤素离子对奎宁有显著的猝灭作用 但对某些物质却无猝灭作用 这表明猝灭剂和荧光物质分子之间的相互作用是有一定选择性的 4 自猝灭 当荧光物质浓度超过1g L时 常发生荧光的自猝灭 浓度猝灭 现象 可能的原因 a 荧光辐射的自吸收 这在荧光物质的吸收光谱和发射光谱有较大重叠时较严重 b 荧光物质的激发态分子M 与基态分子M形成激发态的二聚体 M M c 基态的荧光物质分子的缔合 荧光自猝灭是与浓度有关的效应 因而通过在荧光测定前稀释溶液的办法 可避免这一现象的发生 或减小它所产生的影响 二 荧光分析仪器示意图 1 与分光光度计的差别 荧光分析仪器采用垂直测量方式 荧光分析仪器有两个单色器 一个是激发单色器 置于液槽前 用于获得单色性较好的激发光 另一个是发射单色器 置于液槽和检测器之间 用于分出某一波长的荧光 2 仪器各部分简介 光源激发单色器液槽发射单色器检测器记录仪 激发光源 作用 提供连续辐射 激发样品要求 光源 I0 强度足够 强度与波长无关种类 卤钨灯 高压汞灯 氙弧灯 激发单色器 作用 用于选择激发光的波长 样品池用石英制成形状 正方形 长方形 圆形的 低温测定时在石英液槽外套一个盛放液氮的透明石英真空瓶 发射单色器用于选择投射到检测器的荧光波长 检测器荧光或磷光的强度较弱 要求检测器灵敏度高 光电管 光电倍增管 三 荧光分析方法及应用 1 标准曲线法用已知的标准物质经过和试样同样的处理后 配成一系列标液 测定标液的荧光强度 用荧光强度对标液浓度绘制标准曲线 然后根据试液的荧光强度 在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量 2 荧光分析法的灵敏度 比吸光法高得多 更适合于低浓度物质的分子 这两种方法在灵敏度方面的差别主要是由于同浓度相关的参数的测量方式不同 在光度计中 同浓度相关的参数A是I0 I的对数 在测低浓度液时 检测器必须能区分I I0讯号的微小差别 故在低A时测量的精确度迅速降低 而荧光强度F 或磷光强度P 直接同荧光 磷光 物质的浓度成正比 同浓度相关的参数是在很小噪声背景上的荧光 磷光 发射讯号本身 可用增强入射光强度I0或增大荧光讯号的放大倍数来提高灵敏度 而在光度法中 若检测器放大倍数 I0及I同时 A值不变 故荧光法灵敏度常比相应光度法高2 4个数量级 3 荧光分析法的选择性很多分子在紫外可见区有吸收 但其中只有一部分能再发射荧光或磷光 故荧光法固有干扰很少 选择性较好 4 荧光分析法的应用 5 3磷光分析法 一 概述磷光的产生涉及到激发单重态至激发三重态和由激发三重态经禁阻跃迁回到基态 易受其它辐射或无辐射跃迁的干扰而使磷光强度减弱 甚至完全消失 因此 为获得较强磷光 宜采取下列措施 1 增加试样的刚性 可减小质点间的碰撞几率 以减小无辐射跃迁 低温磷光就是基于这一原理建立起来的 通常 将被分析试样的乙醚或异戊醇溶液置于液氮中 或用二乙醚 异戊烷和乙醇按5 5 2混合称EPA混合溶剂 让其冷冻至玻璃状态后 即可测定磷光 2 室温磷光 固体磷光法在薄层色谱板上分析斑点磷光 可将被分析物质直接固定在薄层色谱板上 而将任何液体溶剂除去 理想的载体应是既能将分析物牢固地束缚在表面或基体中以增强磷光强度 本身又不产生背景 常用的是滤纸和纤维素色层纸 分子缔合物的形成在试液中 表面活性剂与被测物形成胶束缔合物后 可增强其刚性 减小因碰撞而引起的能量损失 例表面活性剂十二烷基硫酸盐和重原子存在下 可测10 6 10 7mol的萘 芘和联苯 精密度达6 3 重原子效应在含重原子的溶剂 碘乙烷和溴乙烷 中 有利于体系间跨跃 磷光增强 另外 还可用Ag 盐 Pb2 盐和Tl 盐等重原子盐类 磷光光度计由光源 激发光单色器 液槽 发射光单色器 检测器等组成 二 磷光分析仪器 1 液槽 为在低温下测磷光 液槽 一个直径为1mm左右的石英管 需放在充有液氮的石英制的小杜瓦瓶中 常用的溶剂是按5 5 2比例混合的二乙醚 异戊烷和乙醇的混合物 称EPA混合溶剂 当它在液氮中冷冻后成为透明的玻璃状物质 2 磷光镜由于发生磷光的物质常伴随有荧光产生 为了区别磷光和荧光 在激发光单色器和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之间各装一个斩波片 并由一个同步电动机带动 这两个斩波片可调节为同相或异相 同相时 磷光和荧光一起进入发射光单色器 测到的是磷光和荧光的总光强 当斩波片调节为异相时 激发光被遮断 此时 由于荧光的寿命短 立即消失 而磷光寿命长 测到的仅为磷光 利用斩波片 不仅可分别测出磷光和荧光 而且可通过调节两个斩波片的转速 测出不同寿命的磷光 这种具有时间分辨功能的装置 是磷光光度计的一个特点 美国P E公司生产的LS 5和LS 3型发光光度计可用于测定荧光 磷光 化学发光和生物发光 三 分析方法及应用一般与荧光分析法相同 采用标准曲线法 与荧光分析法相似 磷光分析法在有机 生物 医药及临床检验等领域中得到了应用 它与荧光法相互补充 成为痕量有机分析的重要手段 5 4化学发光分析法 一 概述 某些物质在进行化学反应时 由于吸收了反应时产生的化学能 而使反应产物分子激发至激发态 受激分子由激发态回到基态时 便发出一定波长的光 这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光 利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法 化学发光也发生于生命体系 这种发光称为生物发光 二 化学发光分析的基本原理1 化学发光反应的条件 化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能 而使反应产物分子激发所发射的光 任何一个化学发光反应都应包括化学激发和发光两个步骤 必须满足如下条件 1 化学反应必须提供足够的激发能 激发能主要来源于反应焓 大多数化学发光反应为氧化还原反应 2 要有有利的化学反应历程 使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态 对于有机分子的液相化学发光来说 容易生成激发态产物的常是芳香族化合物和羰基化合物 3 激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子 而使该分子激发 然后以辐射光子的形式回到基态 2 化学发光反应效率 cl又称化学发光的总量子产率 它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率 ce和激发态分子的发射效率 em 定义为 cl 发射光子的分子数 参加反应的分子数 ce em化学反应的发光效率 光辐射的能量大小以及光谱范围 完全由参加反应物质的化学反应所决定 每个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率 3 化学发光强度Icl以单位时间内发射的光子数表示 它与化学发光反应的速率有关 而反应速率又与反应分子浓度有关 即Icl t cl dc dt式中Icl t 表示t时刻的化学发光强度 是与分析物有关的化学发光效率 dc dt是分析物参加反应的速率 发光强度Icl与分析物浓度成正比 三 化学发光反应的类型1 直接化学发光和间接化学发光直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应 生成电子激发态产物分子 此初始激发态能辐射光子 A B C DC C h 式中A或B是被测物 通过反应生成电子激发态产物C 当C 跃迁回基态时 辐射光子 间接发光是被测物A或B 通过化学反应生成初始激发态产物C C 不直接发光 而是将其能量转移给F 使F跃迁回基态 产生发光 A B C DC F F EF F h 式中C 为能量给予体 而F为能量接受体 2 气相化学发光和液相化学发光按反应体系的状态分类 如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光 在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光 在两个不同相中进行则称为异相化学发光 1 气相化学发光主要有O3 NO