蛋白质化学3.ppt

蛋白质的折叠 1 蛋白质折叠 proteinfolding 使伸展的肽链形成特定的三维结构功能 使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质 过程 3 参与体内多肽链折叠的蛋白质 分子伴侣 molecularchaperone 帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装的蛋白质 Ellis 1987 作用 是防止新生肽链的错误折叠和聚集 而自身并不成为其最后结构的一部分 2 决定蛋白质正确折叠的因素 分子伴侣的类别 4 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质一级结构与功能的关系一级结构决定空间结构 功能与构象有关 一级结构不相同 其功能也不相同 同源蛋白 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质 一级结构的关键部分相同 其功能也相同 具有明显的氨基酸序列相似性 称之为序列同源 相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用 人 猪 牛 羊胰岛素 51个氨基酸 A链的5 6 10和B链的30位氨基酸有差异 但有24个恒定不变 多为非极性 另外6个Cys的数量和位置不变 形成3对二硫键 功能相同 细胞色素c 功能 存在于细胞线粒体 作为电子传递体参与生物氧化 组成 单链蛋白质 104 112 血红素辅基 蛋白质分子中约有38个氨基酸恒定 其余部分的氨基酸则依各生物与人类的亲缘关系远近而有所不同 蛋白质的结构与生物进化 同源蛋白质具有共同的进化起源 根据蛋白质结构上的差异 可断定它们亲缘关系上的远近 生物名称不同氨基酸数生物名称不同氨基酸数黑猩猩0恒河猴1猪 牛 羊10马12鸡13海龟15金枪鱼21小蝇25小麦35酵母44 细胞色素c一级结构的种属差异与经典的形态学分类一致 在分子水平上为生物进化提供了有价值的证据 不同生物和人的细胞色素c中氨基酸组成的差异 一级结构的关键部分变化 生物学活性改变或丧失ACTH 39肽 切去C端15个氨基酸仍有活性 但N端24个氨基酸切去一个就会影响活性 人工只要合成有活性的24肽 一级结构的变化与疾病的关系分子病 蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病 镰刀状红细胞性贫血 Sicklecellanemia 患者镰刀型或月牙型红细胞 镰刀形细胞不能象正常细胞那样通过毛细血管 因此血液循环被破坏 还可能发生严重的组织损伤 镰刀形细胞易破裂 导致红细胞的减少 Sickledcells Affects0 4 ofAmericanblacks 镰刀型或月牙型细胞 Hb 链1234567Hb AH2N Val His Leu Thr Pro Glu Lys Hb SH2N Val His Leu Thr Pro Val Lys 镰刀型贫血病 Hb 链6位的Glu Val 酶原的激活 空间构象的改变 蛋白质构象与功能的关系 S S X 缬 天 天 天 天 赖 异 甘 缬 组46 丝183 静电吸引力或氢键 胰蛋白酶原 胰蛋白酶 SS 活性中心 游离的六肽 胰蛋白酶原的激活过程 血红蛋白 O2结合到一个亚基上以后 影响与其它亚基的相互作用 蛋白质的变构现象 别构效应 别 变 构作用 含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子的构象 性质和功能发生改变的作用 别构效应 allosterism 因别构而产生的效应 别构效应剂 激活或抑制 别构蛋白 肌红蛋白的氧饱和曲线为双曲线型血红蛋白的氧饱和曲线是S型曲线 正协同效应 positivecooperativity 第一个氧分子结合时并不有利 一旦第一个氧分子与一个亚基结合 就使其它氧分子更容易与余下3个亚基的血红素结合 结合每一氧分子都会使血红蛋白对氧的亲和性增加 这种互相作用的结合现象称之结合的正协同性 正协同效应 positivecooperativity 同样当从饱和的氧合血红蛋白失去一个氧分子后 也会使其余的血红素对氧的亲和性降低 myoglobin Hemoglobin 2 8 26 7 5torr 1kPa pO2inlung pO2intissue 0 5 20 40torr 肌红蛋白和血红蛋白对氧亲和性的差异形成了一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统 P50ofMb P50ofHb 波尔效应 Bohreffect ChristianBohr观察到CO2能降低血红蛋白对氧的亲和性 CO2浓度的增加降低细胞内的pH 血红蛋白结合H 和CO2 血红蛋白对氧亲和力下降 血红蛋白的P50升高 波尔效应提高了氧转运系统的效率 有利于血红蛋白在外周组织容易释放氧 在肺部 CO2水平低 血红蛋白很易氧合 BindingofO2inlungswithreleaseofH andCO2 在代谢组织中 CO2水平相对来说比较高 pH较低 氧合血红蛋白易卸载O2 有氧代谢产物二氧化碳和质子对氧合血红蛋白进行调节作用 波尔效应 Bohreffect 2 3 二磷酸 D 甘油酸 2 3BPG 2 3 二磷酸 D 甘油酸 存在红细胞中 与血红蛋白的浓度几乎是等摩尔 血红蛋白的别构抑制剂 2 3BPG降低血红蛋白对氧的亲和性 没有2 3BPG时 在氧分压大约为20torr时 血红蛋白几乎被氧饱和 在组织中20 40torr氧分压下 没有2 3BPG 血红蛋白不能将它结合的氧卸载 在等摩尔的2 3BPG存在下 20torr时只有三分之一的血红蛋白被氧饱和 2 3BPG的别构效应使血红蛋白在组织中氧分压低的情况下可将氧转给肌红蛋白 一 蛋白质的理化性质 蛋白质的主要理化特性 两性解离 胶体性质 光吸收和呈色反应等 蛋白质的理化性质及其分离纯化 蛋白质的相对分子量 10000 1000000之间 R COO H 1 蛋白质两性解离特性 在溶液中上述基团的解离或结合H 的能力不同 因而蛋白质有两性解离特性 在溶液中起酸碱缓冲作用 R NH2 H R S H R COOH R NH3 R SH 等电点 pI 使某一蛋白质所带正负电荷相等时的溶液pH值 pH pI 蛋白质带正电 pH pI 蛋白质带负电 各蛋白质的一级结构不同 pI不同 荷电种类和数量也不同 体内蛋白质pI多5左右 生理条件下一般以负离子形式存在 蛋白质等电点沉淀 离子交换层析和电泳均以蛋白质两性解离和等电点特性为基础 分子表面亲水基团与周围水分子结合形成水化层 分子表面亲水基团可结合或释放H 带一定电荷 水溶液中蛋白质颗粒带相同电荷 2 蛋白质的亲水特性 3 蛋白质的胶体性质 稳定两个主要因素 具有胶体溶液的特点 布郎运动 丁道尔现象 电泳现象 不能透过半透膜 具有吸附能力等 蛋白质溶液 1 胶体颗粒直径2 表面形成水膜 水化层 3 带相同电荷 蛋白质水溶液是稳定的胶体溶液 带正电荷蛋白质 亲水胶体 等点电时的蛋白质 亲水胶体 带负电荷蛋白质 亲水胶体 带正电荷蛋白质 疏水胶体 带负电荷蛋白质 疏水胶体 不稳定蛋白颗粒 沉淀 蛋白质胶体颗粒沉淀 中性盐沉淀反应 高盐破坏水膜 中和电荷 蛋白质聚集沉淀 盐析 蛋白质不变性 4 蛋白质的沉淀反应 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响 低盐浓度蛋白质溶解度增加 盐溶 高盐浓度蛋白质溶解度下降 盐析 分级 段 盐析 不同蛋白质盐析的盐浓度不同 调节盐浓度 使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出 例如 血清球蛋白 50 NH4 2SO4饱和度 清蛋白 饱和 NH4 2SO4 有机溶剂沉淀反应 用与水互溶的乙醇 丙酮等夺取水膜 降低蛋白质的介电常数 等电点时加入更易沉淀 易引起变性 与有机溶剂浓度 作用时间和沉淀温度有关 不同蛋白质所需溶剂浓度不同 分级沉淀 加热沉淀反应 等电点时最易沉淀 加热灭菌 等电点时除去杂蛋白 重金属盐沉淀反应 蛋白质在体内一般为负离子 可与Cu2 Hg2 Ag Pb2 等结合为不溶性蛋白盐而沉淀 生物碱试剂的沉淀反应 蛋白质在pH pI时带正电荷 可与苦味酸 磷钨酸 鞣酸 三氯醋酸 磺基水杨酸等结合沉淀 生物碱试剂 单宁酸 苦味酸 钼酸 钨酸 三氯乙酸能沉淀生物碱 称生物碱试剂 1 可逆沉淀 1 温和条件 通过改变溶液的pH或电荷状况 使蛋白质沉淀 2 沉淀过程中 结构和性质没有发生变化 适当条件下 可重新溶解形成溶液 称非变性沉淀 3 是分离和纯化蛋白质的基本方法 如等电点沉淀法 盐析法和有机溶剂沉淀法等 2 不可逆沉淀 1 强烈沉淀条件 破坏蛋白质胶体溶液稳定性 且破坏蛋白质结构和性质 蛋白质沉淀不可再重新溶解于水 2 沉淀过程发生蛋白质结构和性质变化 称变性沉淀 3 如加热沉淀 强酸碱沉淀 重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀 天然状态有催化活性 S S 恢复 正确配对 非折叠状态 无活性 S S 被还原成半胱氨酸残基 巯基乙醇和尿素对RNase的作用 巯基乙醇和尿素 有活性 蛋白质变性 概念 理化因素作用下 蛋白质分子内的二硫键和非共价键被破坏 分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化 天然构象发生变化 引起蛋白质理化性质和活性的改变 原有性质发生部分或全部丧失 5 蛋白质的变性与复性 变性本质 空间构象的改变或破坏 不涉及一级结构的改变和肽键断裂 变性的主要因素 热 紫外光 激烈的搅拌以及强酸和强碱等 变性特征 1 生物活性的丧失 变性蛋白质主要标志 2 理化性质的改变 分子形状改变 肽链松散伸展 反应基团增加 易被水解 易被酶消化 蛋白质变性后亲水基团被掩埋 溶解度降低 失去水膜 易形成沉淀析出 若溶液pH与蛋白质的pI差别较大 蛋白质仍不易沉淀 球状蛋白质的不对称性增加 粘度增加 扩散系数降低 某些蛋白质结晶能力丧失 蛋白质的复性 有些蛋白质的变性作用是可逆的 其变性如不超过一定限度 经适当处理后 可重新变为天然蛋白质 凝固 变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象 吸收紫外特性 max 280nm 6 蛋白质的其它特性 Trp Tyr Phe等氨基酸残基可特异地吸收紫外光 蛋白质的颜色反应 肽键与碱性铜溶液产生兰色络合物 肽键越多颜色越深 双缩脲反应 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用 生成粉红色的复合物 应用 蛋白质定性定量和检测蛋白质水解程度 酚试剂反应 在碱性条件下 Tyr和Trp与酚试剂化合物 含磷钨酸 磷钼酸 生成兰色物 兰色强度与蛋白质量成正比 应用 常用测定蛋白质 灵敏度高 微克级 只与个别氨基酸有关 标准品应与样品中的Tyr和Trp量接近 蛋白质的颜色反应 二 蛋白质的研究 制备蛋白质 研究步骤 测定蛋白质的一级结构 确定空间结构 鉴定生物学活性 蛋白质的制备 1 前处理 1 选择生物材料 2 加工处理 3 破碎细胞 4 提取蛋白质2 蛋白质的分离纯化 1 前处理 1 选择适当生物材料 科研工作 符合实验预定目标要求 植物 季节性 地理位置和生长环境等 动物 年龄 性别 营养状况 遗传素质和生理状态等 微生物 菌种的代数和培养基成分等 动物 植物 微生物 1 制备用途 2 生物材料种类 工业生产 含量高 来源丰富 制备工艺简单 成本低 抓主要矛盾决定取舍 3 材料保持新鲜 尽快加工处理 暂不提取 冰冻保存 动物深度冷冻 2 加工处理 动物 除结缔组织 脂肪等非活性部分 绞碎 植物 去壳 除脂 微生物 及时将菌体与发酵液分开 组织捣碎器 打碎组织 组织捣碎机 10000r min 20000r min 转10秒 20秒 停10秒 20秒 反复多次 防止发热和升温过高 3 破碎细胞 细胞内或多细胞生物组织中的生物大分子不失生物活性充分释放 1 方法 机械法 方法比较温和 实验室适用 工业生产 电磨研磨 动物 植物和细菌适用此法 研磨 组织剪碎置研钵或匀浆器中 加入少量石英砂研磨或匀浆 方法较剧烈 冷热交替法 90 左右维持数分钟 立即冰浴冷却 反复多次 绝大部分细胞破碎 物理法 细胞内形成冰粒 剩余胞液盐浓度增高 细胞溶胀破碎 反复冻融法 冷冻至 15 到 20 然后放于室温 或40 迅速融化 反复多次 超声波处理法 超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器 防止过热 注意降温 压榨法 1000 105Pa 2000 105Pa高压使细胞悬液 几十毫升 通过一个小孔突然释放至常压 细胞彻底破碎 化学与生物化学方法 自溶法 一定pH和适当温度 细胞的水解酶 如蛋白酶 酯酶等 溶解细胞壁和膜 溶胀法 低渗溶液和低浓度稀盐溶液中 溶剂分子大量进入细胞 细胞膜 半透膜 胀破 酶解法 水解酶 溶菌酶 纤维素酶 蜗牛酶和酯酶等 37 pH8 处理15分钟 专一分解细胞壁 可与研磨法联用 有机溶剂处理法 脂溶性溶剂 氯仿 甲苯 丙酮等 或表面活性剂 SDS 十二烷基硫酸钠等 溶解细胞膜 可与研磨法联用 不同生物体或同一生物体不同部位的组织 细胞破碎的难易不一 使用的方法也不相同 2 选择适当方法 动物脏器 细胞膜较脆弱 容易破碎 植物和微生物 具较坚固的细胞壁 纤维素 半纤维素 采取专门的破碎方法 经过预处理或破碎的细胞置于溶剂 提取液 中 目的产物保持天然状态不失生物活性充分地释放到溶剂中 4 提取蛋白质 目的产物 由固相转入液相 或从细胞内生理状况转入外界特定的溶液中 提取液 应有利于目的产物溶解度增加和保持生物活性 pH值 1 水溶液提取 提取蛋白质和酶最常用的溶剂 蛋白质稳定性好 溶解度大 离子强度 与产物溶解度和稳定性有关 0 02 0 05mol L缓冲液或0 09 0 15mol LNaCl溶液提取蛋白质和酶 稀盐溶液和缓冲液 避免过酸 过碱 一般pH6 8 蛋白质和酶稳定的范围内 常偏离等电点的两侧 对温度耐受力强的蛋白质和酶 可提高温度使杂蛋白变性 温度 0 5 加入少量巯基乙醇或半胱氨酸防止巯基氧化 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用 加入抑制剂或调节提取液pH 离子强度或极性 使水解酶失活 搅拌与氧化 温和搅拌 稀有机溶液提取 2 有机溶剂提取 难溶于水 稀盐 稀酸 或稀碱的蛋白质和酶 常用有机溶剂 常用不同比例的有机溶剂提取 乙醇 丙酮 异丙醇 正丁醇 既溶于稀酸 稀碱 又溶于含有一定比例有机溶剂的水溶液的蛋白质和酶 依据蛋白质与杂质物理 化学和生物学性质差异 选择正确分离纯化方案 2 蛋白质的分离纯化 选择分离纯化方法 探索各个分离纯化方法的实验条件 1 选择分离纯化方法 生物学功能专一性 1 方法 粗略分类 分子大小和形态 溶解度 电荷 性质差异 差速离心 区带离心 超滤 透析和凝胶过滤等 盐析 萃取 分配层析 选择性沉淀和结晶等 电泳 电渗析 等电点沉淀 吸附层析和离子交换层析等 亲和层析等 吸附 萃取 沉淀法 热变性 盐析 有机溶剂沉淀等 离子交换 亲和层析等 2 早期和晚期的分离纯化方法 早期分离纯化 粗分级 特点 粗提取液 物质成份复杂 物理化学性质相近的物质很多 目的产物浓度很稀 对所选方法的要求 快速 粗放 能较大地缩小体积 分辨力不必太高 负荷能力要大 可选用的方法 晚期分离纯化 细分级 吸附层析 盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析 等电聚焦制备电泳 制备HPLC等 可选用的方法 2 蛋白质含量测定与纯度鉴定 1 含量测定 常用方法 Lowry法 标准测定方法 凯氏定氮法 双缩脲法 Folin 酚试剂法 紫外吸收法 染料结合法 胶体金法 蛋白质均一性 2 纯度鉴定 方法 电泳 离心沉降 HPLC和溶解度分析等 常用方法 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 高效液相色谱 HPLC 和毛细管电泳 CE 联合鉴定 必要时再做N 末端氨基酸残基的分析鉴定 同时采用2 3种不同方法确定 3 样品的浓缩 减压加温蒸发浓缩 空气流动蒸发浓缩 冷冻干燥法 吸收法 超滤法 透析法等 制备过程中因过柱纯化 样品变得很稀 为保存和鉴定 需要浓缩 常用方法 4 样品的干燥 干燥后分装并写明标签 制备的产品多是水溶液 为防止变质 易于保存 需干燥 冰冻干燥 真空干燥 冰冻干燥机 先将水溶液冰冻 然后在低温 高真空下使冰升华 得固体干粉 5 样品的保存 加防腐剂和稳定剂 生物大分子的稳定性与保存方法有很大关系 1 干燥制品 一般比较稳定 其活性可在数日甚至数年无明显变化 低温 20 或 70 保存 2 液态贮藏 低温保存 影响样品保存的主要因素 6 时间 生化和分子生物学样品不可能永久存活 1 空气 潮解 微生物污染和自动氧化 2 温度 水参加水解 酶解 水合和加合 加速氧化 聚合 离解和霉变 某些样品可吸收一定波长光 使分子活化不利于保存 尤其日光中紫外线能量大 对制品影响最大 5 pH 保存液态样品时注意其稳定pH范围 每种生物大分子都有其稳定的温度范围 低温抑制氧化 水解等化学反应和微生物 3 水份 4 光线 光化作用 受光催化发生变色 氧化和分解等 等电聚焦电泳 5 0 6 0 7 0 稳定pH梯度 通电 外加电场 蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并停留 聚焦 在等电点pH处 形成区带 IFE isoelectricfocusinggel separatesproteinsbypI SDS PAGE电泳 十二烷基硫酸钠 蛋白质变性并与SDS结合 均带负电 SDS带负电 荷质比相同 separatesproteinsbyMW 介质 凝胶珠 内部为多孔网状结构 凝胶分子筛效应对长短不同棒形分子产生不同阻力 同一电泳条件下 分子小 受阻小 游动快 迁移率大 相对分子质量大者 迁移率小 IEFandSDS PAGE 2Dgelorelectrophoresis permitstheresolutionofcomplexmixturesofproteins andiswidelyusedinproteomics 凝胶电泳流程 电泳分离蛋白切胶回收目的条带扩散回收蛋白 商品化的电泳洗脱蛋白装置优点 快速 效率较高缺点 量少 一般得到的为变性蛋白用途 制备抗体 蛋白序列测定 色谱法 可分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物 如各种氨基酸 糖 蛋白质 一种物理方法 也称层析法 利用混合物中各组分物理化学性质差异 使各组分以不同程度分布在两相中 固定相 流过此固定相的流动相 并使各组分以不同速度移动 从而分离 1 根据两个相的状态和操作方式分类 吸附层析离子交换层析 阳离子交换剂 CM 纤维素 阴离子交换剂 DEAE 纤维素 薄层层析凝胶过滤层析 分子筛 又称排阻色谱 亲和层析 抗原 抗体 配体 受体 金属离子 生物素等 高压液相层析 HPLC 反相HPLC 离子HPLC 凝胶过滤HPLC 2 柱层析 ColumnChromatography 步骤 层析柱通常是玻璃的 长柱分辨率好 大量物质处理则用粗柱比较适宜 装柱 加样 洗脱 收集及分析 离子交换层析 IonExchangeChromatography 1 离子交换层析 简称IEC 概念 依据流动相中组分离子与固定相 离子交换剂 上平衡离子进行可逆交换时的结合力大小差别 进行分离的一种层析方法 生物化学领域中常用方法 广泛应用于各种生化物质如氨基酸 蛋白 糖类 核苷酸等的分离纯化 不溶于水的惰性高分子聚合物基质共价结合某种电荷基团形成一个可进行离子交换的带电基团 平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子 表示 R X Y 或 R X Y 依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化 2 基本原理 1 二相 平衡离子 Y 或Y 高分子聚合物基质 R 电荷基团 X 或X 固定相 离子交换剂 流动相 离子基团 A 和A 一定条件 溶液中某种离子基团 A 和A 与平衡离子 Y 和Y 置换 通过电荷基团 X离子 结合到固定相上 平衡离子 Y离子 进入流动相 基本置换反应 2 离子交换 R X Y R X Y A A R X A R X A 平衡离子带负电 与带负电的离子基团 A 发生交换作用 阳离子交换剂与阴离子交换剂 阴离子交换剂 R X Y 阳离子交换剂 R X Y 平衡离子带正电 能与带正电的离子基团 A 发生交换作用 3 阳离子交换层析基本过程 洗脱液中离子与结合在离子交换剂上A 置换 各种A 按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步洗脱 随洗脱液流出 阳离子交换剂装柱平衡 R X Y 加样 待分离溶液 可能有正电基团 负电基团和中性基团 离子交换 A 与Y 可逆置换 结合到离子交换剂上 R X A 洗脱 负电基团和中性基团不能与离子交换剂结合 随流动相流出去除 Cation exchangeColumn 阳离子 与离子交换剂结合力小的正电基团先被置换 结合力强的需较高离子强度后被置换 各种正电基团按其与离子交换剂结合力从小到大逐步被洗脱分离 选择合适的洗脱方式和洗脱液 增加离子强度的梯度洗脱 随着洗脱液离子强度的增加 洗脱液中的离子逐步与结合在离子交换剂上的各种正电基团进行交换 离子与离子交换剂上 电荷基团 的结合力 静电力 可逆 影响结合强度的因素 4 离子与离子交换剂的结合力 如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为 Li Na K Rb Cs Na Ca2 Al3 Ti4 不同离子有不同的结合力 离子价数越高 结合力越大 价数相同时 原子序数越高 结合力越大