促性腺激素释放激素.doc

促性腺激素释放激素及其受体概述摘要：促性腺激素释放激素（GnRH）是下丘脑分泌产生的神经激素，在体内的重要功能是由促性腺激素释放激素受体（GnRHR）介导的，GnRH 及其受体相互作用的调控在繁殖性能调控中是一个关键性位点。本文从GnRH 及其受体的基本结构及其分布，GnRH 及其受体的表达调控，以及GnRH-R 介导的细胞信号转导机制进行了综述。并展望了GnRH 及其受体的发展趋势及应用前景。关键词：促性腺激素释放激素；促性腺激素释放激素受体；基因调控ABSTRACT：GnRH is the nerve hormone secretion hypothalamus produces, important function of in the body is depending on gonadotropins receptor (GnRHR) mediated , a key site ：GnRH and GnRHR nteraction in the regulation of reproductive performance control . This article from the basic structure of GnRH and its receptor and their distribution, and its receptor expression regulation, and The article reviewed GnRH-R mediated signal transduction mechanism . And it looks forward to the development trend of GnRH and its receptor and the application prospects.Keywords：GnRH；GnRHR；gene regulation1 GnRH的基本结构 目前GnRH 家族至少已经有24个类型，哺乳类具有同一化学结构1。每种哺乳动物的脑至少合成2种GnRH 类型，一种出现在下丘脑而作用于脑垂体，称为GnRt-I；其它1-2种出现在下丘脑以外的脑区，起神经递质作用，间接参与生殖活动的调节，称为GnRH-或GnRH-。 GnRH基因内有3个内含子和4个外显子，由第2、第3外显子和第4外显子的一部分共同编码GnRH 前体，该前体包含一段2123个氨基酸的信号肽、10个氨基酸的GnRH、1个断裂位点和40-60个氨基酸的相关肽(GAP)。信号肽和GnRHs非常保守，但磷酸核糖基甘氨酰胺合成酶(GAPs)在不同物种间同源性很低2。 利用放射免疫和免疫酶标定位技术，现已基本确定GnRH 主要由下丘脑产生。另外，在松果体、脊髓液和脑外组织，包括肠、胃、胰脏、卵巢、输卵管、子宫内膜、胎盘及交感神经节等器官和组织中也发现有GnRH 类似物存在3。可见，GnRH 广泛分布于神经、内分泌、生殖、消化系统和免疫系统，通过传递信息，使各系统达到协调统一。2 GnRH的合成与代谢 GnRH首先在下丘脑视前区的神经内分泌细胞内的核糖体合成一个92个氨基酸的前体，然后被下丘脑的肽酶降解为具有生物活性的激素4，这与其他多肽类激素极其相似。Maurer等5将大鼠视前区/下丘脑组织块在视交叉处均分为嘴侧和尾侧两部分，发现嘴侧虽为GnRH神经元胞体的主要分布区域，但它的GnRH含量只占1/4，其余3/4存在于尾侧。因此，他们认为合成后的GnRH存在于GMKH的释放部位或邻近释放的部位。GnRH 的分泌有一个精确的图线，在胎儿和婴儿早期GnRH发挥短暂的机能作用，婴儿期后期和儿童期其活动被压制到低水平，到青春期被再次激活达成人水平。在青春期初期，GnRH的分泌是在睡眠时，以后是在夜间，但随后昼夜分泌基本一样。在女性，GnRH 的脉冲频率以月经周期的不同阶段而不同。已证实，GnRH分泌呈间歇脉冲式，这种脉冲方式受Ca2+ 、IP3一DAG途径、PKC和DG信号级联等调控，每次间隔30-70min，峰值在10-24rain衰退。GnRH这种脉冲式分泌对维持垂体性腺功能和排卵前期LH峰至关重要。连续或高频率的GnRH脉冲会导致GTH细胞的GnRH 受体脱敏6，而导致LH和FSH 的分泌量降低；而较高频率的GnR_H脉冲有利于LH合成分泌，而较低频率有利于FSH 合成分泌7。但GnRH轴突末梢能如此同步地、协调地将GnRH释放入初级毛细血管网的机理以及调控GnRH分泌的解剖定位还不很清楚。GnRH 在血液中被迅速降解，其生物半衰期约为24min。有关GnRH的降解作用主要来自下丘脑和垂体，其机理可能有2个方面8：一是通过丘脑下部和垂体的GnRH降解酶使之灭活；二是GnRH被内切酶从分子内段裂解为GnRH 1-6肽和GnRH 7-10肽2个片段，然后再通过氨基肽酶和羧基肽酶的作用使之灭活。GnRH主要通过旁分泌自分泌机制，局部调节血浆Gn 以及性类固醇激素的水平，从而改变动物的性行为，因此GnRH可在垂体、性腺等多个水平上影响生殖93 GnRHR的结构和分布 GnRH 受体(GnRHR)是由327-328个氨基酸构成的糖蛋白，相对分子量37684，含7个跨膜区，是典型的G蛋白(protein G)偶联受体。其结构上与其他G蛋白受体显著不同在于缺少细胞内c末端的氨基酸尾巴10。研究证明，细胞内第2和第3环及C末端尾巴对于受体与G蛋白结合、受体专一性决定和脱敏很重要 。其作用机制为：GnRH-GnRH-R-G蛋白(Gq/11，Gs，and Gi)-磷脂酶C(phospholipase C，PLC)-第2信使(肌醇、DG)-蛋白激酶(protein kinase，PKC，PKA，MAPK)和细胞内ca 流动；GnRH还激活PLA、PLD、MAP激酶途径，对细胞膜外信号传导至核内及GTH的转录调节发挥作用。 目前, 大鼠( T sutsumi 等,1992) , 小鼠( Ecdne等, 1992) , 人( kakar 等, 1992) , 绵羊( Bro oks 等,1993) , 牛( kakar 等, 1993) 等许多动物的GnRH-R cDNA 已被克隆和定性, 这些动物的GnRH-R 的cDNA 具有高度的同源性12 。小鼠的GnRH-R 是由327 个氨基酸组成的蛋白质, 有7 个跨膜区, 具有G-蛋白偶联受体的特点, 但没有一个细胞内的C-终端区( 胞内末端的尾部对脱敏和内化十分重要) , 它有3个N-糖基化位点, 而在90, 98, 291 位的酸性氨基酸残基可能和GnRH 的第8 位精氨酸相互作用, 因而对GnRH 的活性起重要作用11 。人GnRH-R 基因全长18.9 kb, 包括三个外显子和两个内含子, 在基因的5q端发现5个假定的启动子和转录起始位点,几个共有顺式作用调控序列( 如PEA-3, AP-1 和Pit-1 位点) 在基因55侧翼区被鉴定, 另外孕酮反应元件、甲状腺素反应元件以及cAMP 反应元件序列在5侧翼区也被发现。在基因的3端发现5个典型的多腺苷酸化信号( poly-A 信号) ,分散在800 bp的区域13。大鼠、小鼠和羊的GnRH-R 基因同人一样,有相似的结构和等同的外显子和内含子剪接位点,然而大鼠和小鼠GnRH-R 基因的转录起始位点与人相比在更下游的位置。小鼠大概是在翻译起始位点上游第62 个核苷酸, 在更上游还有几个次级转录起始位点, 大鼠转录起始位点位于翻译起始密码上游103 nt位置上。由于小鼠GnRH-R 基因的启动子区域中, 并未发现对起始位点精确转录起至关重要作用的多TATA盒13 ,因此推测TAT A 盒的功能可能被其它尚未确定的元件所代替, 大鼠TATA 盒位于转录起始位点前23 nt和人一样, 羊GnRH-R基因包括多个转录起始位点, 但比大鼠和小鼠GnRH-R 基因有着更多的5非翻译区域。因此, 多启动子、转录起始位点和多腺苷酸化信号的发现也许表明GnRH-R 基因存在着种属和组织的特异性调控, 这些DNA 区对GnRH-R 基因表达都非常重要。RNA 印迹、逆转录聚合酶链式反应（Rt- PCR）、原位杂交和受体结合分析表明，在大鼠及猪、牛、羊等哺乳动物垂体细胞中，GnRH 受体是分布在表达LH 或FSH 的促性腺细胞上。除下丘脑- 垂体轴系以外，GnRH 受体在性腺和胎盘中的局部调控机制也一直受到重视。用RT-PCR 等方法证实卵泡颗粒细胞和黄体细胞、睾丸间质细胞（Leydig scell ）、胎盘细胞、滋养层细胞和合体滋养层细胞、正常子宫组织、乳腺组织和前列腺均有GnRH 受体mRNA 的表达。此外，某些肿瘤细胞及外周血单核细胞中也有表达9。4 GnRH-R 基因的表达调控 GnRH 受体基因的表达调控受多种内源性因素的影响, 据初步研究表明, GnRH 受体的合成受四种基本因素调控, 即GnRH 自身, 雌二醇( E2) , 孕酮( P) , 抑制素。由于这些激素通常共同存在于血液循环中, 因此激素之间的相互作用也会影响到GnRHR基因的表达。另外第二信使激活剂、激活素A 对GnRH-R 基因表达也有一定的影响。性周期中GnRH-R 基因表达会随时间而呈动态变化。4.1 GnRH 自身 GnRH 在调控GnRH-R mRNA 水平上是一个关键因素。Brooks 等( 1996) 认为在性周期晚期,GnRH自身是调控GnRH-R mRNA的主要调控子,不是雌二醇14 。目前, 在大鼠上的研究证实GnRH能调控其受体的mRNA, 在大鼠垂体单层细胞中,脉冲式的GnRH 输入会导致GnRH-R mRNA 水平的增加15 。同样, 通过GnRH 激动剂处理, 会引起GnRH-R mRNA 水平的急骤下降 12 。Alba rr acin 等( 1994) 在鼠GnRH-R 基因的5侧区域发现依赖GnRH 的调控元件, 认为GnRH 能增加GnRH-R 基因的转录16 。然而Tsutsumi 等( 1995) 发现持续高浓度的GnRH 导致GnRH 结合位点减少到对照水平的25% , GnRH-R mRNA 水平无变化 17 。Alar id 等( 1995) 也发现GnRH 激动剂连续处理A-T 3-1 细胞124 h, GnRH-R mRNA 水平无变化18 。Albarracint等( 1994) 认为低浓度或脉冲式GnRH 的处理会增加GnRH-R mRNA 水平和GnRH-R 的数量, 而高浓度或连续GnRH 处理会导致GnRH-R 在蛋白质水平上的下调16 。造成与这些差异的原因可能是GnRH 剂量、处理方式和时间的不同而引起的。4.2 雌二醇 Brooks等( 1994) 报道GnRH 激动剂对结合GnRH 或GnRH-R mRNA 表达的抑制可通过急性雌二醇处理消除,其结果导致结合GnRH 和GnRHRmRNA 的升高 12 。在卵巢切除的绵羊, 外源雌二醇的处理也增加了结合GnRH 和GnRH-R mRNA水平 19, 20 。上述结果表明雌二醇对GnRH-R mRNA有直接的刺激作用。Yasin 等( 1995) 认为GnRH-RmRNA 的刺激效果可通过雌二醇得到增强, 这一现象是由于雌二醇提高GnRH 脉冲分泌而引起的21 。综上所述, 雌二醇在调控GnRH-R mRNA 水平方面可通过两个机制: 直接刺激和提高GnRH 脉冲分泌来提高GnRH-R mRNA 水平。在GnRHR功能调控中存在一个“开关”,即从滤泡早期主要，由雌二醇调控而到排卵前后由GnRH 本身所调控。有趣的是, Karsh 等(1992) 和Evans等( 1994) 发现 22, 23还存在另外一个“开关”-GnRH 分泌方式, 从脉冲式到持续式释放。这两个“开关”在调控GnRHRmRNA 表达中同时出现, 这一发现进一步解释了前面的试验结果。4.3 孕酮 Turzillo等( 1994) 发现在诱导黄体萎缩的12 h内, 绵羊的GnRH-R mRNA 明显升高, 这一现象发生在血浆孕酮浓度下降之后, 但在血浆雌二醇浓度升高之前19 。这一实验表明孕酮负反馈的消退在GnRH-R m RNA 表达调控中也许是一个关键性的因子。Turzillo 等( 1995) 认为孕酮浓度的消退也许是通过增加GnRH 的脉冲式分泌来刺激GnRH-RmRNA 水平的表达24。而Wu 等( 1994) 却在体外绵羊垂体细胞培养研究中发现, 通过孕酮直接处理,GnRH-R mRNA 水平下降了50% 25。上述实验表明孕酮也许通过刺激GnRH 脉冲式分泌而间接对GnRH-R mRNA 水平进行调控, 或许通过作用于垂体细胞而直接调控, 或许以上述两种作用的叠加方式进行调控, 这有待于进一步证实。4.4 抑制素 绵羊垂体培养细胞通过抑制素( 滤泡液) 的处理, 对结合GnRH、GnRH-R mRNA 活性和GnRHRmRNA 水平有强大的促进作用 12, 26 。Wu 等( 1994) 也发现抑制素对GnRH-R m RNA 水平有直接的促进效果 25。因此, 抑制素对GnRH-R mRNA水平有上调作用。然而Bro oks 等( 1996) 却发现抑制素在绵羊黄体期对结合GnRH 和GnRH-R mRNA水平无效果, Brooks 等认为导致这一矛盾的原因可能是在培养的垂体细胞中, GnRH 的旁分泌/自分泌调节机制的损失和缺少输入到垂体细胞的GnRH,更有可能是在黄体期分泌着大量的孕酮, 孕酮对GnRH-R mRNA 表达起主要的抑制作用, 而抑制素却又不能消除孕酮的抑制效果而使GnRH-RmRNA 水平被孕酮抑制在基础水平14。4.5 激活素A 实验表明( Tsutsumi, 1995) 激活素A 以时间和剂量为依赖方式刺激A-T3-1细胞GnRH-R 的基因表达水平, 核转录分析和瞬时转染实验证实激活素A处理下的A-T 3-1细胞中GnRH 诱导下的促性腺激素A亚单位启动子的激活。然而Attar d 等( 1995) 的实验则得出相反结论, 他们认为激活素A 阻断A-T 3-1细胞中GnRH 对A亚单位启动子活性的刺激作用。因此, 目前激活素A 在GnRH-R mRNA 水平上的调控机制尚无一致意见。4.6 第二信使激活剂的调节 Alar id 和Mello n( 1995) 报道: T PA ( 可激活蛋白激酶C) 和For skolin( 可激活蛋白激酶A) 两种第二信使激活剂, 在以垂体促性腺细胞系A-T3-1细胞为对象的GnRH-R 基因表达的调控中所得的实验结果不同 18 。T PA 虽然对促进蛋白激酶C 和A亚单位基因表达比GnRH 更有效, 但对GnRH-R mRNA水平的调控却无效, 另外TPA 是否在蛋白水平上影响GnRH 受体数量也不清楚。For skolin 能够在转录后期, 通过降低GnRH-R mRNA 的稳定性而使其水平下调, 同时For sko lin 能够诱导cAMP 特异性升高, 而cAMP 能够在转录水平影响基因表达调控,因此cAMP 或许在转录水平上有助于For sko lin 对GnRH-R 的下调。不过cAMP 诱导的GnRH-R 转录活性的改变需要进一步证实。4.7 性周期 Bauer-Dantoin 等( 1993) 研究表明GnRH-RmRNA 水平在鼠性周期中呈动态变化。GnRH-RmRNA 表达在排卵高峰前逐渐增加, 发情前期的晚期GnRH-R mRNA 达到最高, 这时候GnRH-R 数量最多, GT 对GnRH 最敏感, 峰后GnRH-R mRNA又逐渐减少, 其中发情前期的晚期要比发情后期的早期增加三倍之多 27。GnRH-R mRNA 在性周期的中动态变化, 与垂体上的结合GnRH 数量和从卵巢滤泡分泌的雌二醇的产量密切相关, 反映了雌二醇、孕酮、抑制素等内分泌激素对垂体GT 影响相互作用的综合效应。5 GnRH 受体介导的细胞信号转导机制 当GnRH与细胞膜上的GnRHR 结合后, GnRH将激活其受体以刺激垂体前叶的多种信号通路。GnRHR 与细胞内Gq /11蛋白结合以激活磷脂酶C ( PLC ), 使肌醇磷脂水解为二酰基甘油( DAG)和三磷酸肌醇( IP3 ) 30。DAG 激活胞内蛋白激酶C( PKC)通路和IP3 刺激胞内Ga2 + 的释放。除经典的Gq/11蛋白, Gs蛋白的结合也可以偶尔在特定的细胞中观察到。PKC 激活以适应GnRH 也导致了细胞分裂素活化蛋白激酶( MAPK )通路的增强, 包括垂体细胞中的ERK1、2、5, p38MAPK 和JNK 。活化的MAPK s迁移进入胞核, 在那里激活各种转录因子(如: E ts和/或AP1家族)以调节基因表达。通过这些通路调节LHB和FSHB的合成与分泌, 而在垂体前叶, 选择性地调节促性腺激素从垂体细胞中合成和/或分泌。除GnRHR 激活细胞内信号的直接效应外, 一些研究也表明GnRHR 与表皮生长因子受体( EGFR)相互干扰(图4 ) 可能发生在垂体水平。在LBT2垂体细胞中, Roelle等( 2003)研究表明, EGFR能够通过基于GnRHR 蛋白水解的从跨膜前体释放的局部类EGF配体所激活。在该系统中, 基质金属蛋白酶(MMP) 2和9要求摆脱生长因子以激活EGFR。GnRH刺激细胞以诱导Src、Ras和ERK, 这要依赖于MMPs的作用。GnRH 抑制EGFR 或MMPs信号, 使c-Jun N-端激酶和p38MAPK 得以激活, 但EGFR 或MMPs信号的阻滞又可以抑制GnRH 对c-Jun和c-Fos的激活作用。 GnRH 促使体外培养的促性腺激素细胞在几秒钟内增加细胞内Ca2+ 的含量, 这种效应明显发生在LH 释放之前, 可能是GnRH 与受体结合打开Ca2+通道, 使细胞内Ca2+水平迅速升高, 从而诱导促性腺激素的释放。GnRH 通过与GnRH- R 结合, 还可以刺激受体细胞产生三磷酸肌醇( IP3) 和二酰基甘油( DG) , 而DG 可以激活蛋白激酶并刺激LH 的释放, IP3 则直接刺激Ca2+从细胞内钙库中释放。因此GnRH-R 信号转导是通过与G 蛋白偶联的磷酸肌醇途径及Ca2+介导动员完成的 28 ,其细胞信号转导机制可简述如下: 在GnRH 或其它内源因素的刺激下, GnRH 和GnRH-R 结合, 激活磷脂酶C( PLC) ,促使多聚磷酸肌醇的分解, 形成IP3 和DG, IP3 诱导Ca2+ 从细胞内质网中释放。GnRH 与受体结合的同时也激活了Ca2+ 通道, 促使细胞外Ca2+ 进入细胞内。Ca2+ 和DG 激活蛋白激酶C, 接着细胞内Ca2+ 和蛋白激酶C( PKC) 相互作用进行细胞内反应的调控, 从而诱导促性腺激素的释放。有报道表明GnRH 对促性腺激素A亚单位的激活依靠PKC 途径29 , 然而成熟的促性腺激素释放却依靠GnRH 诱导的细胞外Ca2+ 内流 31 , 因此GnRH 与受体结合所引发的促性腺激素的释放,Ca2+ 和PKC 途径缺一不可。6GnRH受体基因调控的研究展望 目前, 虽然畜禽的生长率大大提高, 然而繁殖力却大大降低了, 因此通过对GnRH 受体基因表达调控的研究从而有效提高畜禽的繁殖力尤为重要。现在国内外科研工作者在认识GnRH 与GnRH 受体调控方面已做了大量工作, 许多畜禽动物的GnRH受体的完整基因已经克隆到, 因此我们可以通过对GnRH 受体基因表达调控分子机制的研究, 从而建立一种有效的方法, 来改变垂体对GnRH 的反应,以提高动物的繁殖力和生育力。此外垂体腺瘤、人乳腺癌、卵巢上皮癌、前列腺癌等肿瘤组织和细胞中也存在GnRH 特异结合位点,在生物体内分布广泛而且不同部位作用不同。因此, 通过对GnRH 受体基因表达调控分子机制的研究, 也将有助于人们进一步了解GnRH 受体在在体内的调节变化机制及在青春发育、生殖调控、肿瘤防治、免疫调节中的作用机制,这将对它们在医学和生产实际的应用产生重大影响。参考文献1 GOR.MAN A，SOWER S A Evolution of the role of GnRH in animalbiologyJGen Comp Endocfinal，2003(134)：2072132 DUBOIS E A，ZANDBERGEN M A，PEUTE J，et a1Evolutionary development ofthree GnRH systems in vertebratesJBrain Research Bullefin，2002，57(3)：4134183 huang W ，Yao B，Sun L，et al . 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