「制备丁二酸相关方法」.doc

生物质发酵生产丁二酸项目调研一、项目可行性报告（一）立项的背景和意义丁二酸（Succinic Acid）又称琥珀酸，是一种重要的“C4平台化合物”，广泛存在于动植物和微生物体内，是TCA循环的中间产物之一，它作为有机合成原材料、中间产物或专用化学品可应用于食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业等众多领域。其中医药领域，主要用于生产琥乙红霉素等药品；农业领域，主要用于生产植物生长调节剂、杀菌剂等；食品领域，主要用于液体调味品及炼制品的风味改良剂等；染料领域，主要用于生产高级有机颜料酞菁红等，2010年丁二酸在这四个领域总价值超过24亿美元。除此之外，丁二酸的主要潜在应用领域是基础化工原料，它可以作为许多重要的中间产物和专业化学制品，还可以取代很多基于苯和石化中间产物的化学品，这可减少在超过300种苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，丁二酸的结构是饱和的二羧酸，可以转化为包括l,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃(THF)、-丁内酯(GBL)、己二酸和N-甲基吡咯烷酮等一系列重要的工业化学品。据统计丁二酸全世界市场需求量可高达2700万t/a，美国能源部发布的报告中将丁二酸列为12 种最有潜力的大宗生物基化学品的第一位。图1.1是以丁二酸及其衍生物为原料的化学制品路线图。图 1.1 丁二酸及其衍生物路线简图采用生物法制备丁二酸的技术将填补了国内生物法路线生产丁二酸的空缺。丁二酸通过加氢还原反应可以制取1,4丁二醇，丁二酸分别与1,4-丁二醇和己二醇进行聚合即可得到生物可降解塑料PBS（聚丁二酸丁二醇酯）和PHS（聚丁二酸己二醇酯）。假如过程中使用的氢气和热量也是使用生物质分解和发酵产生的话，那整个聚酯多元醇领域的原料和能量就应该可以算是与传统能源完全分离了，该项目将成为生物质循环利用的示范性工程。另外，由于石油危机及环境污染的双重压力，生物质发酵法生产丁二酸以其具有节约大量的石油资源并且可以降低由石化方法产生的污染等优点而备受国内外专家学者的重点关注。因此，本技术属于国家鼓励和支持的废弃资源综合利用和节能减排项目，是循环经济和低碳经济发展模式项目，并在2011年获得总统绿色化学挑战奖，也是国家“863”计划和重点鼓励发展类项目，符合国家及部分省市相关产业政策导向。与传统化学方法相比，微生物发酵法生产丁二酸具有诸多优势：生产成本具有竞争力，因此对于聚氨酯行业的发展具有强有力的支撑作用，有助于我国聚氨酯产业发展；利用可再生的农业资源包括二氧化碳作为原料，避免了对石化原料的依赖，实现了使用可再生资源替代不可再生资源进行中间体的制作；减少了化学合成工艺对环境的污染。专家分析认为，未来几年我国聚酯二元醇的年需求量将达到300万吨以上，在面对不可再生能源的紧缺条件下，石化法生产丁二酸的产量将会受到限制，加上PBS产业化技术的完善和国内外对生物可降解塑料需求的不断拓展以及丁二酸新应用领域的不断开发，因而这将给生物质发酵制取丁二酸的应用留下了非常大的发展空间和十分广阔的市场前景。（二）国内外丁二酸研究现状和发展趋势（1）国内外丁二酸市场概述丁二酸是用于化工、制药、食品和农业等领域的一种重要基础原料和中间体。一方面由于石油价格剧烈波动，石化法生产丁二酸的成本一直居高不下，另外发酵法能够使温室气体排放量减少50%，因而发酵法代替石化法生产丁二酸的工艺正在逐渐兴起。另一方面目前绿色化学品的市场需求也在不断增长，自然也会牵动对生物基丁二酸的需求。2011年全球丁二酸的产能约4万吨，其中97%的丁二酸来源于石油基原料，而生物基丁二酸仅占3%，从应用领域来看，丁二酸主要用于树脂、涂料和油漆等领域约占19.3%，其他重要领域包括医药（15.1%）、食品（12.6%）、PBS /PBST（9%）和聚酯多元醇（6.2%）。从丁二酸市场分布来看，2011年，欧洲占市场总量的33.6%，亚太地区占29.6%，北美占29.2%。亚太地区预计将是未来增长最快的市场，如中国、印度和日本，其中，中国处于主导地位（图2.1）图2.1 2011年全球丁二酸市场分布据Transparency预测，全球丁二酸市场将从2011年的2.403亿美元增长到2018年的8.326亿美元，20122018年的年均增长率达19.4%，2018年产量将超过25万吨，1,4-丁二醇、增塑剂、聚氨酯和树脂需求的增加以及涂料、染料和墨水一直是该产品市场的主要驱动因素，然而昂贵的原材料和日益严重的环境问题成为了制约该市场增长的主要因素。1.1 国内丁二酸市场丁二酸在中国的生产始于上世纪60 年代末期，生产发展较快，到2013 年丁二酸的产量占世界总产量的 40%，目前国内丁二酸的总产能约12.5 万吨/年，年产量在6 万吨左右。随着以丁二酸为原料的PBS等新型生物可降解塑料的逐步产业化，丁二酸的发展将迎来新契机。据专家预测，2020年国内可降解生物塑料市场需求量为300 万吨，以生产1 吨PBS需0.6 吨丁二酸计算，未来国内丁二酸的年需求量将达到180 万吨左右，保守估计到2020年，我国生物法丁二酸产能将达到10万吨/年，加上下游市场的不断开发，需求量也将保持10%以上的年增长率，市场缺口巨大。与此同时，国内已有多家企业正在积极筹备上马PBS 项目，而安庆和兴公司则领先一步，率先与清华大学达成合作意向，在目前3000 吨/年规模的基础上，计划在3 年内建设一条10 万吨/年PBS生产线，同时上马的还有与之配套的6 万吨/年丁二酸项目。但一直以不可再生的战略资源石油产品作为原料的传统丁二酸生产方法导致了高价格和高污染，抑制了丁二酸作为一种优秀的化学平台产品的发展潜力，而采用微生物发酵法生产正好可以弥补。1.2 国外丁二酸市场国外丁二酸市场看好，原因是丁二酸的结构是饱和二羧酸，可以转化为1,4-丁二醇、四氢呋喃、-丁内酯等其它四碳的化学制品，它的下游衍生物是很多行业的重要原料，在世界范围内这些衍生物的市场潜力每年超过3106 吨。为了使生物法生产丁二酸能够有效降低成本，美国能源部的4个实验室投资700 万美元，共同研究发酵法生产丁二酸。通过生物发酵法筛选一株优良的菌种，选择利用廉价的原料，经过合理的过程优化，生产出更具优势的丁二酸产品，具有巨大的发展潜力，另外发酵法生产丁二酸也为农业碳水化合物产品打开一个重要的市场。由此可见，发酵法制备丁二酸的研究将成为21 世纪化学工业的一个重要方向，它将使丁二酸及其衍生物市场范围更加宽广。丁二酸的主要应用领域大致可分为5大市场：最大的市场为表面活性剂、清洁剂、添加剂和起泡剂：第二个市场为离子鳌合剂，如电镀行业中的溶蚀和点蚀等；第三个市场是在食品行业中作为酸化剂、PH 改良剂和抗菌剂；第四个市场是与健康有关的产品，包括医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产：第五个市场也是最具发展前景的市场，即作为生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的主要原料。不同市场对于丁二酸的纯度要求也是不同的，这对于生物法制备丁二酸是十分有利的，因为化学法生产的丁二酸由于含有微量的其他不明化合物，限制了其在食品、医药等行业的应用，而生物发酵法生产的丁二酸完全满足美国 FDA 的要求，并且已经给出了安全的许可。（2）国内外生物基丁二酸生产企业概述2.1 国外主要企业经过多年的研发，生物基丁二酸在技术上获得突破，早期存在的生产成本较高、性能不高导致应用范围有限等不足已有明显改善，再加上其所具有的环保优势，这类产品的市场竞争力越来越强。目前，帝斯曼、巴斯夫、Myriant（麦里安科技公司）和BioAmber（生物琥珀公司）均已兴建多个世界级规模的生物基丁二酸生产厂（表2.1）。2.1.1 生物琥珀公司生物琥珀公司是一家从事生物材料加工的公司，于2010年1月22日建成了世界上第一套商业化规模生物基丁二酸装置，采用由小麦衍生的葡萄糖为原料，初期生产能力为2000吨/年。近年来，生物琥珀公司与日本三井公司（Mitsui）合作较为紧密。2013年生物琥珀公司与日本三井公司合作在加拿大安大略省萨尼亚市启动一套大型生物基丁二酸生产装置，初始产能为1.7 万吨/年，并可继续扩能到3.4 万吨/年。2014年生物琥珀公司和日本三井公司还计划再共同建立两套装置，预计总产能将达到16.5 万吨/年。第二个工厂先在泰国建立，再在北美或是巴西建立第三个工厂，两套装置规模相当。通过合作，生物琥珀公司和日本三井公司将充分发挥各自的优势。首先，生物琥珀公司已经研发出一个拥有专利的技术平台，将工业生物技术和专利催化剂结合把可再生原料转化成化学品，从而能降低对石油的依赖，减少成本，其次，生物琥珀公司在法国的工厂能生产并销售丁二酸，已被证明有价格优势。而日本三井公司作为世界上最大的综合贸易公司之一，在国际化学品市场拥有很高的份额，有利于生物琥珀公司生产的生物基丁二酸进行全球市场销售。表2.1 国外主要企业的生物基丁二酸的产能比较公司年产量/吨工厂地址运行时间巴斯夫/Purac 合资公司50000-巴斯夫/Purac 合资公司25000巴塞罗那2013年BloAmber-ARD3000POMACLE（法国）2012年BloAmber/Mitsul合资公司65000TBA（美国或巴西）-BloAmber/Mitsul合资公司17000（前期）34000（后期）萨尼亚市（加拿大）2013年Myriant77110普罗维登斯湖（美国路易斯安那州）2014年Myriant-中国蓝星110000南京（中国）-Myrlant-Uhde（owner and operator）500（第一年）Infraleuna site（德国）2012年Reverdia（DSM-Roquette）10000萨诺斯皮诺拉（意大利）2012年注：来源ISIC公司报告2.1.2 麦里安科技公司美国麦里安科技公司2011年初在路易斯安那州开工建设全球最大的生物基丁二酸工厂，并于2013年第一季度启动其在路易斯安那州普罗维登斯湖产能为1.36 万吨/年的生产装置，计划在2014年初将产能扩大到7.7 万吨/年。2012年，麦里安科技公司与德国洛伊纳（Leuna）的蒂森克虏伯伍德公司（ThyssenKrupp Uhde）合作开始商业化生产生物基丁二酸，生产工艺可达商业化生产规模和产品质量的标准。早在2009年，麦里安科技公司和蒂森克虏伯伍德公司就商业化开发生物基丁二酸签订了独家联盟协议，旨在确保生物基丁二酸生产工艺具有成本竞争优势和生产高纯度产品；目前，麦里安科技公司正在研究与中国蓝星（集团）总公司在南京建设生物基丁二酸项目，此外还与泰国PTT国际化学公司合作，在东南亚建设丁二酸项目。在销售方面，2011年美国麦里安科技公司和日本双日株式会社就缔结销售和市场合作关系，在日本、韩国、中国大陆和中国台湾经销生物基丁二酸，目的是凭借双日株式会社的市场覆盖，极大地提升麦里安科技公司生产的生物基丁二酸在这些地区的长期价值。2.1.3 Reverdia（DSM-Roquette）由荷兰皇家帝斯曼集团（Royal DSM）和法国罗盖特公司（Roquette Frres）合资建成的Reverdia公司，早在2010年初，就在法国Lestrem建成示范工厂，将这种生产技术投入实际运用，并不断进行改进和优化，为产品大规模推向市场作好准备。Reverdia公司于2012年10月开始投产于意大利卡萨诺斯皮诺拉（Cassano Spinola）的第一个商业化的生物基丁二酸项目，初始设计产能为1万吨/年，这也为全球丁二酸项目的大规模启动打下坚实基础。Reverdia公司还是目前唯一一家利用低PH值酵母技术进行大规模商业化生产的公司，该技术的获取源于其公司的示范工厂，被Reverdia公司视作未来进一步提升产品性能的关键要素。通过其掌握的专利生产技术，Reverdia公司有望能够满足全球市场对于丁二酸日益增长的需求，从而确立其在生物基丁二酸生产领域的领导地位。帝斯曼与罗盖特强强联手，结合各自在材料科学与生物技术及植物原料加工方面的优势，构成Reverdia公司发展的强劲推动力。2.1.4 Succinity GmbH（BASF-Purac）巴斯夫及CSM 旗下普拉克（Purac）成立了合资公司Succinity GmbH，总部位于德国杜塞尔多夫。2013年在西班牙巴塞罗那建立的发酵能力为2.5万吨/年的生物基丁二酸装置正式投产。巴斯夫和CSM在2009年已签署共同发展协议并开始对丁二酸进行调研。双方在发酵和下游处理方面的互补优势形成了可持续的高效生产过程。生产中使用的细菌为产丁二酸厌氧螺菌，通过自然过程生产丁二酸。这个过程可以生成很多可再生的原材料，结合了高效和可再生原材料使用的优点，同时还具有较好的固碳效果。另外巴斯夫和CSM还改建了普拉克巴塞罗那附近的一家工厂，用来生产丁二酸，年产能约1 万吨，该工厂在2013年底正式投产，并计划筹建第二个世界级规模的丁二酸工厂，产能达5万吨/年，以满足日益增长的丁二酸使用需求。2.2 国内主要企业国内以微生物发酵为基础的丁二酸绿色生产工艺才刚刚起步，同时由于PBT、PBS树脂、医药及聚氨酯等行业近年来在国内发展较迅速，因而我国每年都要进口大量丁二酸及其下游产品来满足生产需求。我国现有丁二酸生产企业十余家，且大部分均以石化为原料（表2.2）。但我国对生物发酵法制备丁二酸的研究从未间断过，2013年1月28日，扬子石化公司1000吨/年生物发酵法制丁二酸中试装置建成中交，该装置依托扬子石化现有装置及公用工程配套设施，采用中国石化与高校科研单位共同开发的生物发酵法合成丁二酸技术，装置设计生产能力为1000吨/年，年工作日300天，年生产时数7200小时。生物法制取丁二酸项目主要利用可再生生物质资源作为原料，采用丰富的农林生物质资源，确保了生物基丁二酸不受石油价格波动的影响。同时减少石油和煤等不可再生资源的消耗，达到节能减排的效果，为我国循环经济的发展和绿色GDP增长做出突出贡献。表2.2 国内丁二酸生产单位及生产方法生产单位生产方法产能/吨湖北远成化学合成法15001800安徽三信电化学法3000上海申人电化学法600宝鸡宝玉化学合成法1000陕西渭南惠丰化学合成法300临沂市利兴化学合成法10000湖南长岭化学合成法3000武汉金诺化学合成法500吉林市琥珀酸项目发酵法前期3万后期10万扬子石化发酵法1000山东振兴电化学法1000江苏仙桥电化学法1000湖南云溪化学合成法50000山东飞扬电化学法10000（3）国内外丁二酸生产技术现状基于丁二酸在工业中的广泛使用，对应丁二酸的需求量在逐年递增，世界各国对其生产方法研究在不断深入。丁二酸的工业制法较多，目前主要有化学合成法，电化学法和新兴的生物质发酵法，其中发酵法生产丁二酸主要是利用可再生能源和二氧化碳作为原料，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，且成本低廉，环境友好，因此生物法生产丁二酸代表着未来发展的方向。3.1 化学合成法丁二酸的化学合成法主要有石蜡氧化法、乙炔法、催化加氢法、丙烯酸羰基合成法等。石蜡氧化法：传统的生产方法，石蜡在钙、锰催化下深度氧化得到混合二元酸氧化石蜡，后者通过热水蒸汽蒸馏，去除不稳定羟基油溶性酸和酯后，水相中含有丁二酸，干燥后得到丁二酸的结晶（图3.1）。该工艺比较成熟，但收率和纯度都不高，且有污染。催化加氢法：以顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐为原料，采用载有活性炭的镍或贵金属为催化剂，在大约130140，230105 Pa条件下催化加氢得到。顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐的催化加氢体系可分为多相和均相，其中多相催化体系又可分为气相催化加氢体系和液相催化加氢体系。催化加氢法是目前世界上使用最广泛的丁二酸工业合成方法，其转化率高，产率高，产品纯度良好，无明显副反应，但操作要求较高，工艺复杂，成本高，且污染严重。丙烯酸羰基合成法：丙烯酸和一氧化碳在催化剂作用下，生成丁二酸，目前仍未工业化。图3.1 丁二酸石蜡氧化法制备路线简图3.2 电化学法以顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐为原料，电解还原得到丁二酸（图3.2）。电解槽主要分为隔膜和无隔膜两种，工作电极有铅、铅合金、石墨、不锈钢、铜、钛、二氧化钛电极等。电化学还原顺丁烯二酸合成丁二酸主要有两种方式：直接电还原和间接电还原。直接电还原是直接在电极表面由电子进攻双键或活性氢还原生成丁二酸。间接阴极电还原主要以Ti3+ /Ti4+ 为媒质，间接还原顺丁烯二酸合成丁二酸。丁二酸的电化学法虽然具有设备简单，产品纯度高，无污染等特点，但实际生产发现还有许多问题需要解决，如电耗大、离子 膜易破损、阳极消耗严重、工艺操作条件不佳等。图3.2 丁二酸电化学法制备原理简图3.3 发酵法生物发酵法是以淀粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、牛乳或其他微生物能够利用的废料为原料，利用细菌或其他微生物发酵的方法生产丁二酸及其衍生物（图3.3）。丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物。一般情况下，丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌均能够分泌丁二酸。据报道，一些乳酸菌(LactobaciIlus)也能在特定的培养基上不同程度地产生丁二酸。国外在20世纪90年代就开始发酵生产丁二酸的研究，其中认为可接近工业化的发酵水平为产丁二酸浓度60 gL-1以上，糖酸转化率0.8 gg-1和生产效率1.5 g(Lh)-1以上。目前有望成为丁二酸发酵工业生产的微生物菌株主要有：放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)工程菌、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)、曼氏杆菌(Mannhei miasucciniciproducens)以及重组大肠杆菌(Escherichia coli)等（表3.1）和可再生原料如：乳清、糖类、小麦、菊芋粉及木质纤维素等。由于天然菌株产丁二酸的能力非常低，发酵产物多种多样，对糖或丁二酸的耐受性比较差，因此必须运用生物工程技术对现有的菌种进行改良重组。图3.3 丁二酸生物法制备路线简图3.3.1 乳清原料发酵生产丁二酸乳清是奶酪生产过程的副产物，每10 L牛奶可以得到1 kg 奶酪和9 L 乳清。乳清中含有3%8%的乳糖，0.8%1%的牛乳蛋白，1%的盐和0.1%0.8%的乳酸。乳清可以液体、干乳清和乳清渗透物的形式作为发酵原料。密西根大学的Samuelov等最先开始研究厌氧微生物发酵乳清乳糖生产丁二酸的能力，以A. succiniciproducens ATCC29305为模式菌，用分批、连续和补料分批的方式直接发酵乳清生产富含丁二酸的动物饲料添加剂。在灭菌后的粗乳清中补加玉米浆、磷酸盐与镁盐作为培养基，其中乳糖的含量在44.748.7 g/L。A. succiniciproducens在高CO2浓度的环境下培养，发酵液中丁二酸浓度最终达34.7 g/L，其中丁二酸与乙酸的比为4:1，乳糖的消耗率在90%以上，丁二酸对乳糖的产率大于80%，证实了由乳清原料生产丁二酸的可行性。表3.1 国内发酵法制备丁二酸的主要研究进展研究机构研究进展江南大学开展菌株选育和工艺研究，获得比较优良的产丁二酸放线杆菌菌株（Actinobacillus succinogenes CGMCC1593），利用制糖工业的副产物糖蜜为碳源，初始总糖浓度为 65g/L 时，产丁二酸放线杆菌厌氧发酵 48 h，丁二酸浓度可达55.2g/L，生产率 1.15g/（Lh）山东大学底物 52g/L 葡萄糖发酵生产丁二酸达到 26.4g/L，转化率达到50.7%合肥工业大学木质纤维素水解液为碳源时分批培养的丁二酸最后浓度及得率分别为11.73g/L 和 56%，生产率为1.17g/（Lh）；连续培养的丁二酸得率为 55% ，生产能力为3.19g/（Lh）南京工业大学采用稀酸水解玉米籽皮制备混合糖液，脱毒脱色后，产丁二酸放线杆菌NJ113 培养基总糖浓度为50g/L 时，丁二酸分批发酵的质量收率可达0.68g/g，浓度可达34.2g/L，生产强度达0.83g/（Lh），总糖浓度为68.2g/L 时，丁二酸质量收率仍可达0.62g/g，浓度为42.3g/L，生产强度为0.98g/（Lh）烟台大学进行好氧发酵研究，对丁二酸产生菌 S-1 进行紫外线和亚硝基胍的复合诱变后，筛选出丁二酸产量高、遗传性状稳定的菌株S-57，并对其进行激光诱变，筛选出菌株 SH-24，丁二酸产量达到 21.25g/L。经鉴定该菌为总状枝毛霉Mucor racemosus Fresenius）SH-24韩国Lee等报道了A. succiniciproducens ATCC29305和M. succiniciproducens MBEL55E分批、连续发酵乳清生产丁二酸的情况。在基础盐与乳清组成的培养基上，A. succiniciproducens ATCC29305菌体不生长，但在补加酵母膏和聚蛋白胨的乳清培养基中，菌体生长与产酸。当葡萄糖和乳清作为混合底物时（20 g/L乳清和7 g/L葡萄糖），丁二酸产率和生产强度分别为95% 和0.46 g /（L h），丁二酸浓度达15.5 g/L，比单以乳清为底物时的生产强度高出近一倍。在最佳的稀释速率下连续发酵，丁二酸的生产强度达到1.35 g/（L h），并且发酵液中，丁二酸与乙酸比值提高到5.1:15.8:1。用玉米浆代替乳清培养基中的酵母膏，M. succiniciproducens MBEL55E分批发酵乳清原料产丁二酸13.0 g/L，丁二酸产率和生产强度为71%和1.18 g/（L h）。以稀释速率为0.6h-1 连续厌氧发酵时，丁二酸产率63%69%，生产强度达到3.9 g/（L h），比分批培养提高了3.3倍。结果表明了用廉价的乳清和玉米浆为原料可以有效的生产丁二酸。最近 Wan等研究用Actinobacillu ssuccinogenes 130z发酵奶酪乳清也能生产丁二酸。50 g/L奶酪乳清的培养基，丁二酸的产率57 %，生产强度0.44 g/（L h），乙酸和甲酸为主要副产物。3.3.2 糖类原料发酵生产丁二酸含有由葡萄糖和果糖组成的二糖植物通常称为糖料植物，甜菜和甘蔗是蔗糖和糖蜜的主要来源，甜高粱也可作为蔗糖的来源。糖蜜是制糖工业的副产品，糖蜜一般含有大约40%50%（质量分数）总糖（主要成分是蔗糖、葡萄糖和果糖），是发酵工业中较廉价的碳源原料。糖蜜除了比葡萄糖价格低廉外，还含有多种微生物生长所需要的营养素如维生素，氨基酸和矿物质等，是一种理想的发酵生产丁二酸的原料。印度Agarwal等报道从牛瘤胃中分离获得的产琥珀酸E. Coli，在优化后的含甘蔗糖蜜和玉米浆的培养基中，其丁二酸的产量比用葡萄糖和蛋白胨培养基的产酸提高了9倍。在10L发酵罐中，初始甘蔗糖蜜总糖浓度50 g/L，36 h生成17 g/L丁二酸，丁二酸的产率和生产强度分别为34%和0.5 g/(Lh)。刘宇鹏等研究用A. succinogenesCGMCC1593发酵甘蔗糖蜜生产丁二酸，工业废糖蜜经酸预处理后作为培养基的碳源，培养液中总糖浓度为64.4 g /L，其中含44.9 g /L蔗糖，9.8 g /L葡萄糖，7.2 g /L 果糖，分批发酵48 h产丁二酸46.4 g/L，丁二酸产率79.5%。在5 L发酵罐中进行补料分批发酵，丁二酸浓度可达到55.2 g/L。董晋军等研究了用甘蔗糖蜜原料半连续发酵生产丁二酸工艺，采用两级双流式半连续发酵操作，39个批次(一级罐连续时间269 h)， 二级发酵罐平均产酸43.5 g/L，平均生产强度达到2.07 g /(Lh)，较相同有效装液量的分批发酵或补料分批发酵单位时间产发酵液体积提高23倍。甜高粱是一种新型绿色可再生高能作物，平均含糖量7%15%，其茎秆中富含50%70%糖汁，茎汁中的糖分以蔗糖为主（最高占79%），其次是葡萄糖和果糖，茎汁中还含有N、Mg、Ca元素。因此也可以作为发酵的碳源。表3.2 5 L发酵罐中甜高粱榨汁糖浆补料分批发酵生产丁二酸情况发酵时间/h丁二酸/(g/L)甲酸/(g/L)乙酸/(g/L)残糖/(g/L)00.000.770.2139.5586.052.632.6225.631623.053.794.6320.112430.383.504.4223.253239.691.014.4622.984054.0904.2312.564458.8504.898.214859.8004.867.50江南大学郑璞课题组采用收割后的甜高粱秆榨汁，榨汁液进行发酵产丁二酸试验，得到较好的结果（表3.2）。榨汁液发酵培养基中以玉米浆为氮源，初始还原糖浓度60.5 g/L，在5 L发酵罐中，A. succinogenes CGMCC 1593分批发酵48h，产丁二酸47.2 g/L。补料分批发酵时，通过补加甜高粱榨汁糖浓缩液，控制发酵液中的糖浓度在2030 g/L。发酵48 h，总投入甜高粱榨汁糖浆糖浓度为80.4 g/L（按最终体积计），发酵剩余还原糖浓度为7.5 g/L，产丁二酸浓度59.8 g/L，较分批发酵提高了21%，生产强度1.25 g/(L h)。试验结果表明有良好应用前景。3.3.3 小麦水解发酵生产丁二酸谷类植物是淀粉的主要来源，杜晨宇等进行了以小麦为原料发酵丁二酸的研究。整个过程分两个阶段，第一阶段运用真菌将小麦淀粉转化为发酵原料，第二阶段用A. succinogenea ATCC55618发酵产丁二酸。一种方法是将泡盛曲霉Aspergillus awamori 2B.163在含8%小麦粉的培养基中液体发酵96 h，发酵滤液（含30 g/L的葡萄糖和100 mg/L的氨基氮）用于A. succinogenea发酵，产丁二酸5 g/L，副产物乳酸2.9 g/L，丁二酸对小麦粉产率为0.063 g/g。另一种方法，用富含葡萄糖淀粉酶的Asp. awamori发酵滤液，水解面粉产生葡萄糖富集液，将Asp.awamori 发酵滤渣中的菌丝体自溶，制成氨基氮富集液，两者混合成含葡萄糖45 g/L，氨基氮500 mg/L的培养基，经A. succinogenea发酵可产生16 g/L丁二酸，副产物8 g/L乙酸和6 g/L甲酸，丁二酸对小麦粉的产率为0.19g/g。另外在第一阶段中，改用双菌固体发酵产酶，将泡盛曲霉 Asp. awamori 和米曲霉Asp. oryzae分别在小麦麸皮培养基中固体发酵产淀粉酶和蛋白酶，然后分别用提取的酶液水解小麦粉和面筋蛋白，制备含葡萄糖浓度140 g/L以上的糖富集液，与含3.5 g/L以上游离氨基氮的富集液。两种富集液混合作为A. succinogenea ATCC55618发酵的原料，发酵过程添加MgCO3，丁二酸浓度达到64 g/L。说明小麦可作为发酵丁二酸的一种有效原料。3.3.4 菊芋粉发酵生产丁二酸菊芋是多年生块茎植物，菊芋块根成分中除水分外，含有大量菊糖，可达干重的70%80%，菊糖是以b-1, 2键连接的末端有一个蔗糖基的多聚果糖，使聚合度为3234的多糖。菊糖水解后得到果糖和葡萄糖，不需提纯可直接用于发酵。因此，也是发酵工业上一种较廉价的碳源。江南大学郑璞课题组研究了菊芋为原料A.succinogenesCGMCC1593发酵生产丁二酸。黑曲霉Asp. niger SL-09发酵产菊粉酶，酶活达到46 U/mL发酵液。该发酵液在50条件下按10%加量与菊芋粉作用，水解得到菊芋糖浆。A. succinogenes CGMCC 1593在含还原糖浓度为53.5 g/L的菊芋糖浆发酵培养基中发酵36 h，产丁二酸43.5 g/L，生产强度1.22 g/（Lh）。另一方面初步研究了菊芋同步糖化发酵工艺。菊芋粉为培养基碳源，玉米浆为氮源，按每克底物加入40U菊粉酶的比例加入Asp. niger SL-09培养液，60保温10 min后，降温到37 ，接入A. succinogenes SF-9进行同步糖化发酵，发酵72 h。产丁二酸59 g/L，在此基础上采用补料发酵，发酵过程总投入约菊芋粉192 g/L（总计还原糖134 g/L），发酵96 h，丁二酸浓度98 g/L，表明同步糖化发酵菊芋原料生产丁二酸有较好的应用价值。3.3.5 木质纤维素原料生产丁二酸木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，用于工业发酵原料的木质纤维素主要有农业废弃物如秸秆、木材和木质生物质等。木质纤维主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素是由b-1，4-糖苷键连接而成的多糖，半纤维素是由带支链的多聚糖（主要是已聚糖和戊聚糖）组成的杂多糖，而木质素是一种酚醛聚合物。三者组成的木质纤维素具有很强的抗水解和酶解特性，因此木质纤维素作为发酵原料必须经过预处理才能使用。美国芝加哥大学的Donnelly2004年申请了E.coli 基因工程菌（ptsG、pflB、ldhA突变株AFP184，AFP400，AFP404）发酵工业级水解液（Arkenols hydrolysate，玉米水解糖浆和纤维素水解糖浆）生产丁二酸的专利。采用两段式发酵，前期耗氧（6h），后期流加含有木糖的工业级水解糖浆并通CO2厌氧发酵，192 h积累丁二酸63 g/L，丁二酸对底物的产率在0.6:11.3:1。有报道该技术已于2002年在Applied CarboChemials Inc.（ACC）公司进行了中试规模试验。韩国 Lee PC等报道了木材水解液发酵产丁二酸。采用2mm4 mm大小的橡木块，于215 汽爆预处理，再用纤维素酶，按每克底物20IU的用量，在50 下水解3d，得到含葡萄糖和木糖分别为20 g/L和7 g/L的木材水解液。A.succiniciproducens在木材水解液发酵培养基中（含还原糖糖27 g/L，玉米浆10 g/L）分批发酵，积累丁二酸23.8 g/L，对糖产率和生产强度分别为88%和0.74 g/(L h)。Kim DY等研究了M.succiniciproducens MBEL55E发酵木材水解液生产丁二酸，在橡木材水解液发酵培养基灭菌前，用NaOH预处理以减少灭菌过程所产生的抑制物质，NaOH处理后的木材水解液含葡萄糖16 g/L，木糖7 g/L，M.succiniciproducens MBEL55E发酵12 h，积累丁二酸11.7 g/L，丁二酸产率56%，生产强度从未预处理时的0.60 g/(Lh)提高到1.17 g/(Lh)，在稀释速率0.4 h-1的条件下连续发酵，丁二酸的产率55%，生产强度提高到3.19 g/(Lh)。瑞典Hodge等研究了软木材稀酸水解液脱毒及脱毒水解液用于基因工程菌E. coli AFP184生产丁二酸的发酵。稀酸水解木质纤维素的过程中，会产生对微生物生长与发酵有害的酚醛类等物质。采用云杉木碎片，先在PH值2、170 的条件下稀硫酸水解7 min，以水解其中的半纤维素，余下固体部分再在pH值2、200 的条件下稀硫酸水解10 min，合并两步酸水解液，浓缩后用5%活性炭吸附脱毒。E. coli AFP184在脱毒水解液发酵培养基中，菌体生长与产酸加快；而在未经脱毒处理的水解液发酵培养基中，菌体不能生长与产酸。将脱毒处理的水解液用于E. coli 的丁二酸发酵，先好氧培养11 h，再厌氧发酵42 h，可积累丁二酸42.2 g/L，丁二酸产率72%。国内姜岷等报道了用玉米皮水解液为原料发酵产丁二酸。粒径为2040目的玉米皮在料液比18%，l10 ，l%硫酸条件下水解90 min，总糖浓度达85 g/L，总糖收率90%。酸水解液用活性炭脱色，脱色率达92%，脱色的总糖损失率低于5%，糠醛含量仅为0.236 g/L。脱色后的糖液用于A. succinogenes NJ113发酵产丁二酸，初始糖浓度为50 g/L时，丁二酸浓度达35.8 g/L，丁二酸产率为71.6%，验证了玉米皮水解液可替代葡萄糖作为丁二酸发酵的碳源。陈可泉等用酸水解玉米纤维，采用CaCO3中和与活性炭脱色处理酸水解液，有效去除了水解液中抑制发酵的物质，得到的水解糖液用于A. succinogenes NJ113发酵产丁二酸，在7.5L发酵罐上，产丁二酸浓度达35.4 g/L，丁二酸产率72.5%。李兴江等报道了水解玉米秸秆发酵生产丁二酸。采用碱解和酶解法处理，40目的玉米秸秆按1:5的比例在PH值12的碱性水溶液中，95 搅拌60 min，然后用50 Hz超声处理30 min，硫酸中和PH值至中性，分离硫酸钙沉淀。清液中加入纤维素酶和半纤维素酶，60 搅拌酶解180 min。200 g秸秆粉水解得到52 g葡萄糖和24 g木糖。通过优化培养基中镁、锰、亚铁、锌离子和维生素的含量以及CO2与H2的比例、氟乙酸的浓度，A. succinogenes FH-7发酵产丁二酸浓度达到73 g/L。采用酸解和酶解法，玉米秸秆先经180 汽爆10 min，再用0.4%硫酸高压水解，水解后固体部分用纤维素酶和半纤维素酶在50 下酶解72 h，合并两部分水解液，2000 g干秸秆共得到154 g木糖和293 g葡萄糖。用A. succinogenes S.JST 的pta-adh突变株M.JSTA，在10 L发酵罐中发酵，总糖浓度为64 g/L，发酵液积累丁二酸56 g/L。此外，有报道日本地球环境产业技术研究机构成功地使用转基因棒状杆菌，从废纸中制取出琥珀酸，最终可从每升培养液中提取约30 g的琥珀酸，认为可将琥珀酸制造成本降低90%。目前发酵生产的丁二酸的价格在0.551.1美元/kg。基于这一生产成本，上述的丁二酸衍生物比目前石化原料生产的有竞争力或接近有竞争力。发酵法生产的丁二酸通过多年的实验，以及不同国家公司中试的实践，在技术、环保、安全、经济等指标的考核均已经成为一个共识，这个工艺线路有潜力成为大量生产化学制品，也可作为大部分重要的中间产物和专业化学制品得基础。上述文献报道的研究结果反映了利用这些廉价的原料生产丁二酸，具有良好的可行性和应用前景。（4） 发酵法生产丁二酸的提取研究进展与石化法工生产丁二酸相比，采用生物发酵法可降低一些生产成本，其中分离提取技术大约占总生产成本的50%。廉价生物质如木质纤维素的应用虽能降低发酵成本，但也向发酵液中引入更多的外来成分，包括蛋白质、木质素、果胶以及纤维素等，并且目标产物的浓度通常比单糖发酵偏低，另外除了目标产物，发酵液中本身还存在一些其他的化合物，如代谢副产物、细胞和残留的原料等，最终导致其下游分离过程比单糖发酵或化学合成更难规模生产。目前微生物发酵生产丁二酸的分离方法主要包括以下几种：沉淀法、电渗析法、溶剂萃取法以及离子交换法。4.1 沉淀法沉淀法主要包括钙盐法、铵盐法以及近来研究比较多的酯化法。4.1.1 钙盐法通过加入氢氧化钙或氧化钙生成沉淀，以达到从发酵液中分离的效果，是传统工业上分离羧酸的常用方法。钙盐法的具体步骤如下：先加入氧氧化钙或氧化钙，将得到的丁二酸钙盐从发酵液中过滤分离出来，用浓硫酸处理，得到副产物硫酸钙，游离的酸通过一些方法（如：活性碳、离子交换等）进行纯化，最后蒸馏得到丁二酸晶体（图4.1）。钙盐法因为工艺成熟、设备简单、原材料易得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛使用。但经过这么多年的应用，其缺陷日益显露：一是得到的提取液中丁二酸质量分数较低，增大了后续浓缩段的负荷；二是单元操作损失多，总收率低；三是在提取过程中丁二酸经历了多次相变，消耗化工原料多，固液分离量大，能耗高；四是环境污染严重，产生大量的固体废弃物CaSO4，每生产出l mol的丁二酸产品，就产生出等摩尔的石膏副产物。因此，钙盐法提取有待于进一步的提高。图4.1 钙盐法提取流程简图4.1.2 铵盐法Berglund和Dunuwilal在美国专利中，提出一种即不消耗大量试剂，也不产生大量副产物的生产和纯化丁二酸的工艺，在生产过程中硫酸铵副产物可实现循环利用。生产及纯化的第一步是种子接种到发酵罐中，用NaOH调节发酵液的PH6.0以上，在PH为7.0的时候最佳。第二步是通过过滤器，将不溶的蛋白质和杂质除去。得到的丁二酸钠质量分数为10左右，通过多效蒸发器浓缩至50%，在结晶器中，通入CO2及氨气，将丁二酸钠盐转化为丁二酸铵盐，然后在丁二酸结晶器中，加入NH4HSO4将PH调为1.51.8，进行结晶。在这个PH下，丁二酸的溶解度最小，而且丁二酸铵与硫酸氢铵反应生成硫酸铵和丁二酸，所以丁二酸能析出来。通过过滤器，洗涤，再通过甲醇纯化器，将丁二酸从相对不溶的硫酸盐中分离出来，最后蒸发，可以得到纯的丁二酸。甲醇蒸发，被回收到甲醇贮罐中。从结晶器出来的NaHCO3可以被用来调节发酵罐的PH。从过滤器出来的滤液含有(NH4)2SO4、残留的丁二酸、NH4HSO4及硫酸，与甲醇纯化器中出来的硫酸盐一起进入热分解器中。这个过程是为了将残留的丁二酸从硫酸盐中分离出来，以减少送入热分解器中的硫酸盐混入有机物，在分解过程中造成焦化。硫酸盐大部分为硫酸铵，部分为残留的硫酸氢铵和硫酸，将其置于热分解器中，温度维持在300左右。在这个温度范围内，硫酸铵裂解成为氨和硫酸氢铵，也可能形成硫酸。硫酸氢铵、残留的硫酸和残留的未分解的(NH4)2SO4可循环到丁二酸结晶罐，氨可加到结晶罐中将钠盐转化成铵盐。结晶器中出来的滤液包含甲醇和残留的丁二酸，在甲醇分离器中蒸馏后，残留的丁二酸和一些硫酸盐水溶液与发酵罐出来的稀丁二酸二铵溶液混合一起进入多效蒸发器浓缩。这样就完成了一个闭合的清洁生产流程，整个工艺流程中，结晶的丁二酸是唯一的产物（图4.2）。目前铵盐法提取工艺流程只是实验阶段，是利用模拟体系的丁二酸通过铵盐法提取收率达到94.9%，硫酸的回收率为96.7，甲醇的回收率为94.9。铵盐法路线长，结晶过程条件比较苛刻，还需要高温裂解硫酸盐，步骤繁琐，难度大，操作费用高，增加了运行成本，不利于发酵制备丁二酸的规模化生产。图4.2 铵盐法提取流程简图4.1.3 酯化法在生物发酵法产丁二酸的发酵液中，丁二酸以盐的形式存在(微溶于醇溶剂)，加酸使丁二酸盐酸化为丁二酸与水合盐(不溶于醇溶剂)，加入醇溶剂后盐析形成沉淀，同时丁二酸与醇溶剂发生酯化反应，溶于醇溶剂中。此酯化反应是可逆反应，将醇溶剂蒸馏除去，余下的晶体即为生物基丁二酸。反应式如下：反应式 (1)、(2)均为可逆反应，当醇过量时，反应向正反应方向进行；当醇不足时，反应向逆反应方向进行，由此达到分离纯化生物基丁二酸的目的。4.2 溶剂萃取法溶剂萃取技术用于分离提取发酵制得的生物制品已经有几十年的历史，并且在过去20年中对以发酵为基础的产品的生产技术的改进起了一定作用。溶剂萃取技术的原理主要是利用发酵液中丁二酸和其他杂质组分在萃取剂中的溶解度不同，把丁二酸萃取到溶剂相中。再经过减压浓缩，结晶，干燥最后得到产品。目前常用的萃取剂大多是叔胺类，主要有三丙胺(TPA)、三丁胺(TBA)、三戊胺(TPcA)和三辛胺(TOA)。Won Hi Hongt等人报道了通过液液萃取的方法，以TOA为萃取剂，可以选择性的将乙酸从发酵液中除去，控制PH5.0时，可以将丁二酸/乙酸的比例由原来的4.9变为9.4。2006年，Yun Suk Huh利用Mannheimia succiniciproducens葡萄糖为碳源发酵生产丁二酸，通过溶剂萃取法，收率可以达到73.1，纯度达到99.8，其工艺流程（图4.3）。使用这种方法的缺点是在提取过程中需使用大量有机溶剂。同时，在食品级和医药级产品的生产中将对最终产品的质量有不良影响。文献中还没有关于采用三辛胺进行大规模生产的成本问题以及三辛胺是否能够回收利用的报道。图4.3 萃取法提取流程简图4.3 离子交换吸附法在上世纪七、八十年代，离子交换吸附法开始应用于发酵液中有机酸的分离提取。它是利用特定的有机高分子树脂的高选择离子交换性，通过寻找、使用合适的树脂，直接从处理后的发酵滤液中提取有机酸或其盐类。国内一般的流程是将发酵液经过滤后用离子交换柱交换吸附，氨水洗脱后过阳离子交换柱转型，再经活性炭脱色、除杂后浓缩，结晶，最后得到有机酸产品。目前，对于离子交换吸附法提取丁二酸的报道较少，只有Brian H.Davison等人研究了在模拟体系中丁二酸的提取，他们筛选出两种弱碱性阴离子树脂XUS40285和XFS40422，表现出对丁二酸有较好的吸附容量，同时可以将丁二酸和发酵副产物完全分开，利用盐酸来洗脱，可以使丁二酸的浓度由初始浓度10g/L提高到40110g/L，该树脂再生后，操作10个周期，并且间歇操作的收率达到95以上。离子交换吸附法工艺简单，与钙盐法相比，由于减少了丁二酸的相变过程，能耗大大降低；生产过程中不产生大量的石膏废渣，大大降低了工人的劳动强度，也改善了周围环境；重要的是提高了丁二酸的收率。当然，该工艺也存在一些缺点，例如，离子交换树脂在使用中需要频繁再生，会产生大量废水；再之，离子交换树脂具有一定的寿命，也需要经常更换，会产生大量的固体废弃物。因此，寻求或研制高效、寿命长、易回收利用的离子交换树脂，废液的循环利用或零排放，就成为该工艺得以工业化推广的关键。4.4 固体膜分离法用于发酵有机酸分离提取的固体膜分离法主要有两种超滤法和电渗析法。4.4.1 超滤法超滤是一种以压力差为推动力，按粒径选择分离溶液中所含的微粒和大分子的膜分离操作，只是简单的物理分离过程。该工艺简单，易于控制，且不会产生污染。它的关键是选择合适孔径的耐酸超滤膜，由于其易堵塞，所以超滤法一般只作为一种预处理手段，截留发酵液中的大分子有机物，如残糖、蛋白质、未发酵的原料颗粒等，以减轻后续提取工序的污染。南京工业大学发明了涉及一种丁二酸的分离提取方法，特别是利用膜分离，活性炭脱色及结晶技术从厌氧发酵法制备的发酵液中分离提取丁二酸的方法。该方法主要包括：将厌氧发酵的丁二酸发酵液采用孔径为0.10.5m的微滤膜过滤，然后用超滤