溶血及试剂.doc

石头城细胞膜的通透性观察一、实验目的 1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。 2.了解溶血现象及其发生机制。 二、实验原理 细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。 三、实验用品 (一) 材料 鸡血细胞 （二）器材 普通显微镜、普通离心机、扭力天平、10ml 试管、10ml 刻度离心管、试管架，2ml 注射器（无需针头）或5ml 移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。 （三）试剂 1Alsever 溶液 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89g 柠檬酸（C6H 6O7.H2O） 0.05g 氯化钠 0.42g 蒸馏水 100ml 调PH 至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置4冰箱保存。 2. 0.128 mol/L NaCl 溶液。 3 0.05 mol/L NaCl 溶液。 4 0.4 mol/L NaCl 溶液。 3. 0.128 mol/L NH4Cl 溶液。 4. 0.128 mol/L NH4AC 溶液。 5. 0.128 mol/L NaNO3溶液。 7. 0.32 mol/L 葡萄糖。 8. 0.32 mol/L 甘油。 9. 0.32 mol/L 乙醇。 10. 0.32 mol/L 丙酮。 11. 蒸馏水。四、实验操作 1从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsevers 液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2 周内使用）。 2. 使用前，取用Alsevers 液保存的新鲜鸡血5ml ， 加入8ml 的0.128 mol/L 的NaCl 溶液，小心混匀，1000 r/min 离心5min，如此3 次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。 3. 取11 支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2 滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。 五、观察结果 1. 试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（），镜检红细胞完好呈双凹盘状。 2. 如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（或），镜检有部分红细胞呈碎片。 3. 如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（），镜检发现细胞全部呈碎片。 六、实验建议 1. 鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。 2. 目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液； 3. 试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。 七、实验报告及作业表4-1 各种溶液的溶血现象观察结果书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表4-1。 目测法判断标准：快速溶血：；慢速溶血：或；不溶血：此帖被评分,最近评分记录 金钱:5(minglu79)常用溶液的配制 2006-4-26 12:55:00 | By: 尔然 （一）溶液配制注意事项1药品要有较好的质量 试剂分为优级纯（保证试剂，Guaranteed reagent，GR）、分析试剂（Antalytical reagent，AR）化学纯（Chemical pure，CP）和实验试剂（Laboratory reagent，LR）等等。工业用的化学试剂，杂质较多，只在个别情况下应用，如配洗液用的硫酸、配干燥剂的氯化钙等。2药品称量要精确。3配制试剂用水应用新鲜的去离子水或双蒸馏水，比电阻值在50万欧姆以上，pH在5.57.0之间才可应用，在组织培养等特殊用途时应注意此项要求，配制一般化验用溶液只要求用双蒸馏水或去离子水。配好后的溶液，应立即除菌处理（如高压灭菌、抽滤或加抑菌物质），以防杂菌生长。（二）0.067（1/15）Mol/L磷酸缓冲液11/15Mol/L磷酸二氢钾溶液的配制：称取磷酸二氢钾（KH2PO4，AR）9.08g，用蒸馏水溶解后，倾入1 000ml容量瓶内，再稀释至刻度（1 000ml）。2/15Mol/L磷酸二氢钠溶液的配制：称取无水磷酸氢二钠（Na2HPO4，A.R.）9.47g（或者Na2HPO42H2O 11.87g）用蒸馏水溶解后，放入1 000ml容量瓶内，再加蒸馏水稀释至刻度（1 000ml）。3按附表的比例，配制成不同pH值的缓冲溶液。附表1 磷酸盐缓冲液配制法（单位：毫升）pH1/15Mol/L Na2HPO41/15Mol/L KH2PO4pH1/15Mol/L Na2HPO41/15Mol/L KH2PO45.88.092.07.166.690.17.272.028.06.012.287.87.376.884.77.380.881.47.522.477.67.687.013.06.426.773.37.789.410.66.531.868.27.837.562.57.943.556.58.849.64.26.955.444.68.297.03.07.098.02.0（三）0.15Mol/L PB液附表2 0.15Mol/LPB液配制法pH0.15Mol/L Na2HPO4（ml）0.15Mol/L NaH2PO4（ml）6.426.573.56.637.562.56.849.051.07.061.039.07.272.028.07.481.019.07.687.013.0Na2HPO42H2O分子量=175.05 0.15Mol/L溶液含26.7g/L。Na2HPO412H2O分子量=358.22 0.15Mol/L溶液含53.7g/L。NaH2PO4H2O分子量=138.00 0.15Mol/L溶液含20.7g/L。NaH2PO42H2O分子量=156.03 0.15Mol/L溶液含23.4g/L。（四）0.2Mol/L PB缓冲液附表3 0.2mol/L PB缓冲液配制法pH0.2 Mol/L Na2HPO4（ml）0.2Mol/L NaH2PO4（ml）5.88.092.06.012.381.56.426.573.56.637.562.56.849.051.07.061.039.07.272.028.07.481.019.07.687.013.07.894.75.3 0.2Mol/L Na2HPO42 H2O溶液35.61g/L Na2HPO412 H2O溶液含71.64g/L 0.2Mol/LNaH2PO4H2O溶液含27.60g/L NaH2PO42 H2O溶液含31.21g/L欲配0.1Mol/L PB缓冲液则在0.2Mol/L PB缓冲液的基础上加H2O稀释1倍即可。欲配制PBS液时，则在溶液中加0.85的NaCl溶液即可。（五）无钙镁离子磷酸缓冲盐水（PBS）（0.15Mol/L PH 7.2） NaCl 8.0g KCl 0.2g Na2HPO4 1.15g（如为Na2HPO412H2O，则为2.89g） KH2PO4 0.2g将上述试剂依次溶于1 000ml去离子水中，完全溶解后，115高压灭菌10min15min，存在4冰箱中备用。此液可用于配制和稀释细胞分散剂以及洗涤细胞培养物。（六）硼酸盐缓冲液（Borate saline buffer） 文章来自： 医药园 () 整理：zfg1硼酸（3BO3）0.2Mol/L硼酸：硼酸12.37g加水至1 000ml。2硼砂（Na2B4O7）0.05Mol/L硼砂：硼砂19.07g加水至1 000ml。附表4 不同pH的0.2Mol/L硼酸缓冲液配制法pH0.05Mol/L硼砂（ml）0.2Mol/L硼酸（ml）pH0.05Mol/L硼砂（ml）0.2Mol/L硼酸（ml）7.41.09.07.82.08.08.76.04.08.03.07.09.08.02.0（七）巴比妥缓冲液1pH8.2离子强度0.05Mol/L巴比妥缓冲液 巴比妥钠 47.6g 蒸馏水 3 000ml 1.17N HCl 55.0ml （1.17 N HCl=193ml浓HCl加1 807ml蒸馏水） 将4.76g巴比妥钠溶于3 000ml蒸馏水。 加1.17 N HCl 55ml。 用HCl调节pH到8.2，并加蒸馏水至4 265ml。 2pH8.4 0.06Mol/L巴比妥缓冲液 巴比妥 1.84g 巴比妥钠 10.30g 加蒸馏水至 1 000.00ml 3pH8.6 0.06Mol/L巴比妥缓冲液 巴比妥 1.66g 巴比妥钠 12.76g 加蒸馏水 1 000.00ml（八）0.2Mol/L醋酸盐缓冲液 见表附表5附表5 0.2Mol/L醋酸盐缓冲液配制法pH0.2Mol/LTris（ml）0.1Mol/LHCl（ml）pH0.2Mol/LTris（ml）0.1Mol/LHCl（ml）233723379.108.952558.067.902527.58.928.76257.57.967.822530.08.758.602510.57.877.732532.58.628.482512.57.777.632535.08.508.372515.57.667.522537.58.408.272517.57.547.402540.08.328.182520.07.367.222542.5（九）三羟甲基甲烷盐酸缓冲液（TrisHCl缓冲液）不同pH，0.05Mol/L25ml0.2Mol/L三羟甲基氨基甲烷加ml0.1NHCl，加水稀释至100ml（见下表）附表6 TrisHCl缓冲液配制法 pH0.2Mol/LTris(ml)0.1NHCl(ml) pH0.2Mol/LTris(ml)0.1NHCl(ml)233723379.108.962558.057.902527.58.928.78257.57.967.822530.08.748.602510.07.877.732532.58.628.482512.57.777.632535.08.508.372515.07.667.522537.58.408.272517.57.547.402540.08.328.182520.07.367.222502552545.08.148.002525.025三羟甲基氨基甲烷（Tris）分子量=121.140.2Mol/L三羟甲基氨基甲烷：Tris24.23g，加水至1 000ml。0.1NHCl：取HCl8.6ml，加水至1 000ml。（十）0.5Mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液NaHCO3 3.70gNa2CO3 0.60g溶于600.00ml蒸馏水中即得。不用时塞紧瓶塞，以免吸收空气中二氧化碳使PH下降。最好小量配制。（十一）甘油磷酸缓冲液1配制pH8.0磷酸缓冲液 0.1Mol/L Na2HPO4 94.50ml 0.1N NaH2PO4 5.50ml 混合即可29份甘油与1份pH8.0磷酸缓冲液混合，即为甘油磷酸缓冲液。用途：用于免疫荧光试验。（十二）Hanks液1贮存液 NaCl 80.00g KCl 4.00g Na2HPO412 H2O 1.52g KH2PO4 0.60g 葡萄糖 4.00g 0.4酚红液 50.00ml 双馏水加至 100.00ml115高压灭菌15min，冰冻保存。2工作液 贮存液 1份 双馏水 9份115高压灭菌15min。临用时用灭菌的5.6NaHCO3液调pH值至7.2左右（溶液呈橙红色）。（十三）萘（钠）氏试剂（Nesslers reagent）配方1：氯化汞 6.0g 碘化钾 12.4g 20NaOH 30ml 加蒸馏水至 100ml配方2：碘化汞 11.5g 碘化钾 8g 蒸馏水 50ml （完全溶解后）过滤，加20NaOH 50ml。 用途：检测溶液中氨离子。（十四）阿氏（Alsevers）液 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠 0.80g 氯化钠 0.42g 蒸馏水 100ml 溶解后，以10%柠檬酸调节pH至6.1，过滤，分装，10磅10min灭菌，4保存。（十五）青、链霉素混合液（简称SP液或双抗液） 青霉素（40万U） 5支 链霉素（200万g） 1支 分别溶于100ml灭菌无离子水中或共同溶于200ml灭菌无离子水中，混合后分装小瓶，置-10-20冰箱保存备用（1万单位g/ml）。 临用时，按1%的量加入营养液或其他溶液中，最后浓度是青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml。（十六）洗液（清洁液）配方1：重铬酸钾 150g 蒸馏水 300ml 浓硫酸 3 000ml将重铬酸钾加入蒸馏水中，使之自然溶解或水浴溶解，亦可在大坩埚中加热溶解，然后慢慢加入浓硫酸，边加边搅拌，见发热过剧则稍停，冷却后再继续加。此为强洗液。盛清洁液的容器要坚固，上加厚玻璃盖，操作时要穿橡皮围裙、长统胶靴、戴上眼镜和厚胶皮手套，以保安全。洗液一旦变绿，表示铬酸已经还原，失去了氧化能力，不宜再用。如将这样洗液加热，再加适量重铬酸钾，又可重新使用。配方2：浓硫酸 50% 蒸馏水 50% 重铬酸钾 5%此为中等强度洗液。配方3：重铬酸钾 100g 蒸馏水 1 000ml 加热溶解，冷却后缓慢加入 工业硫酸 100ml此液为弱洗液，为棕红色。使用此液时，必须预先用热肥皂水将玻璃器皿洗净，经自来水冲洗，沥干然后才能浸入，否则该洗液很快失效。二、犊牛血清的制备选择健康犊牛，一般为初生至六个月龄，最好是刚出生尚未吸乳的公犊牛，采血前12h不予喂饲，仅予水喝。采血时采用颈动脉，动脉插管，乳胶管、盛血容器均应洗净灭菌。将采血筒中放入少量Hanks液，将胶管连接至玻璃管（弯）放入瓶口，然后瓶口包以硫酸纸、白布和普通纸，系紧。插管也用硫酸纸包扎系好。采血前将犊牛固定，最好放在手术台或固定架上固定好头部和四肢，局部剪毛消毒，切开，剥离颈动脉，止血钳夹好，消毒，切开动脉管壁，插入插管，另一助手轻摇采血筒中的Hanks液以湿润瓶壁，这样有利于凝血，也有利于血凝块与瓶壁的分离。这时术者即可放血。每个采血筒内采适量不宜超过总容量的13，装的过多则出血清少。采血时还须注意动脉插管口不宜太细，放血速度也不宜过快，过快过慢均可引起溶血。盛血的采血筒应置室温（天热时）或温箱中，温室（天冷时）中，静置4h以上，待血液凝固后放入4冰箱或冷库中过夜。然后在无菌间，小心（不要摇晃）倒出或用虹吸法吸出上清液，如混有红血球，则将这部分血清以2 000r/min离心10min15min注