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实验十三 PCR产物的纯化与克隆 一 概述 扩增的PCR产物如利用T Vector可直接进行克隆 如用自备的平末端或粘性末端载体连接 往往需要将产物纯化 克隆的主要方法有 1 平末端连接 由于TaqDNA聚合酶往往在PCR产物3 端加上多余的非模块依赖碱基 在用平末端连接克隆PCR产物前 可用Klenow片段或T4DNA聚合酶处理补平末端 2 在PCR产物尾部加dT或ddT TaqDNA聚合酶会在3 端加上多余的非模块依赖碱基 而且对A优先聚合 所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A 利用这一特点 载体平末端用酶加上dT或ddT 使载体在PCR产物末端互补并进行连接 载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP 3 粘性末端连接 利用引物中附加在5 端的限制酶位点 直接将PCR产物经适当的限制性内切酶切割后产生粘性末端 与载体连接 产生重组DNA 二 PCR产物的纯化 V geneDNA清洁试剂盒 操作步骤在PCR反应液中加三个体积的PCR A溶液 最终体积为100ul 混匀后转移到制备管中 将DNA制备管置于2ml离心管中 3600rpm离心lmin 弃滤液 将制备管置回离心管 加0 5mlWl溶液 3600rpm离心30S 弃滤液 将制备管置回离心管 加0 7mlW2溶液 3600rpm离心30s 弃滤液 以同样的方法再用0 7mlW2溶液洗涤一次 将制备管置于离心管中 12000rpm离心1min 将制备管置于清净1 5ml离心管中 在DNA制备膜正中央加25 30ul水或洗脱液 室温放置1min 12000rpm离心lmin洗脱DNA 三 载体加dT尾方法 实验步骤 将1ulpUC19用SmaI全酶切 在小管中按上述PCR反应 加入各种混合物 其中4ul4种dNTP改为4ul25mmol LdTTP 加入1ul 5单位 的TaqDNA聚合酶在72 下加热2小时 用酚 氯仿 异戊醇抽提两次 加入两倍体积无水乙醇 在 20 下沉淀1小时 离心 用70 乙醇漂洗后 真空抽干 溶于10ulddH2O中 目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3 T Vector 四 PCR产物与载体粘末端连接 在7ulPCR产物中加1ul带dT尾的pUC质粒 T Vector 加1ulT4D
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