第三章 细胞生物学研究方法.ppt

第三章细胞生物学研究方法 进行初步观察 形成可验证的假说 设计对照试验 收集资料 解释结果 作出合理结论 查阅已有知识 生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制 如何学习细胞生物学 抽象思维与动态观点结构与功能统一的观点同一性 unity 和多样性 diversity 的问题细胞生物学的主要内容 结构与功能 动态特征 细胞的生命活动 实验科学与实验技术 细胞真知源于实验室 Whatweknow Howweknow 第三章细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养 细胞工程与显微操作技术 第一节细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术 lightmicroscopy 电子显微镜技术 Electromicroscopy 扫描探针显微镜 ScanningProbeMicroscope 扫描遂道显微镜 scanningtunnelingmicroscope 第二节细胞组分的分析方法 离心分离技术 细胞内核酸 蛋白质 酶 糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术 第三节细胞培养 细胞工程与显微操作技术 细胞的培养 细胞工程 一 光学显微镜技术 lightmicroscopy 普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术 FluorescenceMicroscopy 激光共焦扫描显微镜技术 LaserConfocalMicroscopy 相差显微镜 phase contrastmicroscope 微分干涉显微镜 differentialinterferencecontrastmicroscope DIC 录像增差显微镜技术 video enhancemicroscopy 二 电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术 扫描电镜 Scanningelectronmicroscope SEM SPM Scanningprobemicroscope 三 扫描遂道显微镜 ScanningProbeMicroscope SPM 80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器 包括 STM AFM 磁力显微镜 摩擦力显微镜等原理 扫描探针与样品接触或达到很近距离时 即产生彼此间相互作用力 如量子力学中的隧道效应 隧道电流 原子间作用力 磁力 摩擦力等 并在计算机显示出来 从而反映出样品表面形貌信息 电特性或磁特性等 装置 扫描的压电陶瓷 逼近装置 电子学反馈控制系统和数据采集 处理 显示系统 特点 1 可对晶体或非晶体成像 无需复杂计算 且分辨本领高 侧分辨率为0 1 0 2nm 纵分辨率可达0 01nm 2 可实时得到样品表面三维图象 可测量厚度信息 3 可在真空 大气 液体等多种条件下工作 非破坏性测量 4 可连续成像 进行动态观察 用途 纳米生物学研究领域中的重要工具 在原子水平上揭示样本表面的结构 普通复式光学显微镜技术 光镜样本制作分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 荧光显微镜技术 FluorescenceMicroscopy 原理与应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位 如绿色荧光蛋白 GFP 的应用 激光共焦扫描显微镜技术 LaserScanningConfocalMicroscopy 原理 应用 排除焦平面以外光的干扰 增强图像反差和提高分辨率 1 4 1 7 可重构样品的三维结构 相差显微镜 phase contrastmicroscope 将光程差或相位差转换成振幅差 可用于观察活细胞 微分干涉显微镜 differential interferencemicroscope 偏振光经合成后 使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别 增加了样品反差且具有立体感 适于研究活细胞中较大的细胞器 录像增差显微镜技术 video enhancemicroscopy 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动 电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图 负染色技术 Negativestaining 与金属投影染色背景 衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术 Freezeetching 技术示意图 冰冻断裂与蚀刻复型 主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构 快速冷冻深度蚀刻技术 quickfreezedeepetching 电镜三维重构技术电子显微术 电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术 电镜三维重构技术与X 射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合 是当前结构生物学 StructuralBiology 主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段 扫描电镜 原理与应用 电子 探针 扫描 激发样品表面放出二次电子 探测器收集二次电子成象 CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题 一 离心分离技术 用途 于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心 分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心 精细组分或生物大分子的分离 二 细胞内核酸 蛋白质 酶 糖与脂类等的显示方法 原理 利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量 FeulgenStaining 三 特异蛋白抗原的定位与定性 免疫荧光技术 快速 灵敏 有特异性 但其分辨率有限 图 蛋白电泳 SDS PAGE 与免疫印迹反应 Western Blot 免疫电镜技术 免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术 免疫胶体金技术应用 通过对分泌蛋白的定位 可以确定某种蛋白的分泌动态 胞内酶的研究 膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等 四 细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术 同位素标记或荧光素标记的探针 电镜水平的原位杂交技术 生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合 PCR技术 五 放射自显影技术 原理及应用 利用同位素的放射自显影 对细胞内生物大分子进行定性 定位与半定量研究 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究 步骤 前体物掺入细胞 标记 持续标记和脉冲标记 放射自显影 六 定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度术 Microspectrophotometry 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收 测定这些物质 如核酸与蛋白质等 在细胞内的含量 包括 紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪 FlowCytometry 主要应用 用于定量测定细胞中的DNA RNA或某一特异蛋白的含量 测定细胞群体中不同时相细胞的数量 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞 分离DNA含量不同的中期染色体 一 细胞的培养 动物细胞培养 类型 原代培养细胞 primaryculturecell 继代培养细胞 sub culturecell 细胞株 cellstrain 正常二倍体 接触抑制 细胞系 cellline 亚二倍体 接触抑制丧失 植物细胞 类型 原生质体培养 体细胞培养 单倍体细胞培养 花药培养 非细胞体系 cell freesystem 二 细胞工程 细胞融合 cellfusion 与细胞杂交 cellhybridization 技术 单克隆抗体 monocloneantibody 技术图 细胞拆合与显微操作技术 物理法结合显微操作技术 图1 图2 化学法结合离心技术 制备核体 karyoplast 和胞质体 cytoplast 其它技术遗传分析 mutant knockout knockin 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 细胞生命活动 突变体分析 突变体分析 蛋白修饰分析 基因表达 多肽定性分析 生物信息学 序列测定 双向电泳分析 DNA分离与克隆 机器人技术 robotics 功能基因组学 蛋白质分离与制备 蛋白质组学 Caenorhabditiselegans Drosophilamelanogaster Arabidopsisthaliana Hela细胞 左 CHO细胞 右 的培养 现代分子细胞生物学中几种常用技术与研究手段 一 PCR技术及其应用 二 DNA检测技术及其应用 三 基因组测序技术及其应用 以HGP为例 四 体细胞克隆技术及其应用 五 杂交瘤技术及其应用 以单克隆抗体生产技术为例 六 细胞信号转导研究技术 以本室研究内容为例 七 组学技术及其在转基因食品安全性评价中的应用 一 PCR技术及其应用1 PCR技术基本原理2 PCR技术应用实例 1 利用PCR技术对食品中致病微生物的快速检测请同学们根据PCR的原理自己设计 技术要点 优 缺点 2 利用PCR技术对基因进行定点突变 3 利用PCR技术研究蛋白质结构与功能之间的关系 利用PCR技术对基因进行定点突变例如 设计一实验方案将一个已知基因的3 端的第7位碱基由A定向突变为C 利用PCR技术研究蛋白质结构和功能之间的关系例如 设计一实验方案检验一已知蛋白质的C末端的3个氨基酸是否是该蛋白质生物学活性的必需氨基酸 二 DNA检测技术及其应用1 DNA检测技术原理2 在刑事侦察中的应用 三 基因组测序技术及其应用 以HGP为例 1 了解基因组测序的基本流程 2 DNA测序反应的原理 四 体细胞克隆技术及其应用克隆的概念clone 由同一个细胞祖先经分裂 繁殖所形成的纯细胞系 克隆的类型 体细胞克隆 分子克隆 基因克隆克隆动 植物 利用单个细胞通过无性繁殖产生出的个体 克隆动物的基本原理 克隆羊Dolly1996年7月5号罗斯林研究所维尔默特 Wilmut NATURE 1997年2月27号 植物克隆 快速繁