紫外-可见分光光度法00.doc

第九章 紫外-可见分光光度法【学习目标】 1.掌握紫外-可见光谱的基本概念、有机化合物中电子跃迁的基本类型、紫外-可见光谱的定性分析方法和定量分析方法；2.熟悉紫外-可见光谱仪的基本原理；3.了解无机化合物的紫外-可见吸收光谱。4.能使用紫外-可见光谱法进行物质的定性和定量分析。 紫外可见分光光度法（ultravioletvisible spectrophotometry）是根据物质分子对波长为200800nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法(60-400nm)和可见分光光度法(400-800nm)合称为紫外一可见分光光度法。这种分子吸收光谱源于价电子或分子轨道上电子的电子能级间跃迁，广泛用于无机和有机物质的定量测定，辅助定性分析（如配合IR）。 第一节 紫外可见吸收光谱一、分子吸收光谱的产生分子由于受到紫外-可见光电磁辐射，分子间电子跃迁产生。通常，分子是处在基态振动能级上。当用紫外、可见光照射分子时，电子可以从基态激发到激发态的任一振动（或不同的转动）能级上。因此，电子能及跃迁产生的吸收光谱，包括了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带，这就是为什么分子的紫外、可见光普不是线状光谱，而是带状光谱的原因。在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。下图为分子的能级示意图。图9-1 分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图 分子总能量：E分子 = E电子 + E振动 + E转动当用频率为的电磁波照射分子，而该分子的较高能级与较低能级之差E恰好等于该电磁波的能量 时，即能量变化的大小和入射光频率的关系为： E = （ 普朗克常数h=6.62410-34Js=4.13610-15eVs，频率，s-1,）此时，在微观上出现分子由较低能级跃迁到较高的能级；在宏观上则透射光的强度变小。用一连续辐射的电磁波照射分子，将照射前后光强度的变化转变为电信号，并记录下来，然后以波长为横坐标，以电信号（吸光度 A）为纵坐标，就可以得到一张光强度变化对波长的关系曲线图-紫外可见吸收光谱图。 二、分子吸收光谱类型根据吸收电磁波的范围不同，可将分子吸收光谱分为远红外光谱、红外光谱及紫外、可见光谱三类。 分子的转动能级差一般在0.0050.05eV。产生此能级的跃迁，需吸收波长约为250 25的远红外光，因此，形成的光谱称为转动光谱或远红外光谱。 分子的振动能级差一般在0.05 1 eV，需吸收波长约为25 1.25mm的红外光才能产生跃迁。在分子振动时同时有分子的转动运动。这样，分子振动产生的吸收光谱中，包括转动光谱，故常称为振-转光谱。由于它吸收的能量处于红外光区，故又称红外光谱。电子的跃迁能差约为1 20 eV，比分子振动能级差要大几十倍，所吸收光的波长约为12.5 0.06mm，主要在真空紫外到可见光区，对应形成的光谱，称为电子光谱或紫外、可见吸收光谱。 通常，分子是处在基态振动能级上。当用紫外、可见光照射分子时，电子可以从基态激发到激发态的任一振动（或不同的转动）能级上。因此，电子能级跃迁产生的吸收光谱，包括了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带，这就是为什么分子的紫外、可见光谱不是线状光谱，而是带状光谱的原因。又因为绝大多数的分子光谱分析，都是用液体样品，加之仪器的分辨率有限，因而使记录所得电子光谱的谱带变宽。由于氧、氮、二氧化碳、水等在真空紫外区（60 200 nm）均有吸收，因此在测定这一范围的光谱时，必须将光学系统抽成真空，然后充以一些惰性气体，如氦、氖、氩等。鉴于真空紫外吸收光谱的研究需要昂贵的真空紫外分光光度计，故在实际应用中受到一定的限制。我们通常所说的紫外可见分光光度法，实际上是指近紫外、可见分光光度法。3、 紫外-可见吸收光谱的特征及其表示方法紫外可见吸收光谱是由分子中的电子能级跃迁而产生的，位于可见紫外区，可用紫外可见光光度计进行测定。将不同波长的的光一次通过一定浓度的被测物，并分别测定不同波长的吸光度，以波长作为横坐标，一吸光度作为纵坐标所得的吸光度波长曲线，及吸收光谱（见图9-2）。 图9-2 不同浓度的KMnO4紫外吸收曲线 吸收光谱示意图1-吸收峰；2-谷；3-肩峰；4-末端吸收 吸收光谱又称吸收曲线，从9-2图可以看出它的特征：曲线1处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长（max)。在曲线2处有一个谷称最小吸收，它所对应的波长，称最小吸收波长（min)。在1峰旁3处有一小峰，称肩峰。在吸收曲线最短的一端，吸收较强但未形成峰形成峰部分，称为末端吸收。吸收曲线的横坐标，一般用波长（或频率）表示。一定的波长对应一定的能量。不同物质的分子由于结构不同，发生越前时吸收光的能量也不相同，即吸收峰的位置也不同。所以吸收曲线在横坐标的位置可作为分子结构的表征，是定型的主要依据。max是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，对鉴定化合物尤为重要；整个吸收光谱的形状决定于物质性质，反应分子内部能级分布情况是物质定性的依据。 四、紫外-可见分光光度法的特点1. 灵敏度高。由于相应学科的发展，使新的有机显色剂的合成和研究取得可喜的进展，从而对元素测定的灵敏度大大提高了一步。特别是由于多元络合物和各种表面活性剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到几十万。相对于其它痕量分析方法而言，光度法的精密度和准确度一致公认是比较高的。不但在实际工作中光度法被广泛采用，在标准参考物质的研制中，它更受重视，很多光度分析法已制定成为标准方法。2. 选择性好。目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法了。另外，在多组分共存的溶液中，可以毕竟分离而测定某种预定测组分。3. 通用性强，应用广泛。不仅可用于无机化合物的分析测定，更重要的是由于许多有机化合物在紫外光区具有特征的吸收光谱，因而用来进行有机化合物的鉴定及其结构分析。分析由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素（除少数放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法。4. 设备和操作简单，价格低廉，分析速度快。广泛地应用于化工、冶金、地质、医学、食品、制药等部门及环境监测系统。单在水质分析中的应用就很广，目前能用直接法和间接法测定的金属和非金属元素就有七十多种。所涉及的水样包括雨水、泉水、井水、饮用水、江水、湖水、河水、海水以及各种废水等。光度法比较成熟，可测元素多，灵活性强。有些大型仪器不易解决的分析问题，光度法可以发挥作用。在有机分析中，紫外-可见光谱(UV-VIS)可作定量测定外，在定性分析和结构分析方面，它可作为红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)、质谱(MS)等方法的辅助手段。5. 准确度较好。对于一般的分光光度法来说，其浓度测量的相对误差在1-3%范围内，如采用示差分光度法测量，则误差往往可减少到千分之几。但仅适应于微量成分的测定二不适应于中、高含量的测定。6. 紫外-可见分光光度分析法的局限性。很多有机化合物在紫外光区没有吸收或吸收不强烈。也有些有机化合物在紫外光区的吸收过于简单，缺少惊喜结构，因而不足用来作为鉴定的依据。但作为物质结构分析的一种手段，紫外-可见分光光度分析法应具有一定的实用意义。在国际上发表的有关分析的论文总数中，光度法约占28%，我国约占所发表论文总数的33%。由于各种各样的无机物和有机物在紫外-可见区域都有吸收，因此均可借此方法加以测定。到目前为止，几乎周期表上的所有元素（除少数放射性元素和惰性气体外）均可采用本法测定。在国际上，将1985-1989年分析仪器的世界销售额按31大类进行分类统计，其中UV VIS分光光度计一直占有5-6%的份额，排名第五。由于光度计的价格相对比较低廉，故若以仪器销售的台数技术的话，则分光光度计将排在第二位。仪器的销售情况可以从侧面反映各类分析仪器在实际使用中的广泛和频繁程度。 紫外-可见分光光度法在药物分析中的应用历来受到大家的广泛关注和重视,世界各国都进行这一领域的相关研究。据统计,在药物分析中，分光光度法占29.1%，色谱法占25.5%，荧光、化学发光法占2.4%，与光度法有关的方法共计占31.5%，由此可见，紫外-可见分光光度法是药物分析最常用的方法之一。研究结果表明，紫外-可见光度法在药物分析中的可靠性可以和色谱法相蓖美，但其设备简单、操作方便、价格低廉、易于普及等特点是色谱法难于做到的。因此，可以相信，光度法在药物分析中将大有作为。 紫外可见分光光度法在医药方面的应用第二节 化合物紫外可见光谱的产生在紫外和可见光谱区范围内，有机化合物的吸收带主要由ss*、pp*、ns*、np*及电荷迁移跃迁产生。无机化合物的吸收带主要由电荷迁移和配位场跃迁（即dd跃迁和ff跃迁）产生。 由于电子跃迁的类型不同，实现跃迁需要的能量不同，因此吸收光的波长范围也不相同。其中ss*跃迁所需能量最大，np*及配位场跃迁所需能量最小，因此，它们的吸收带分别落在远紫外和可见光区。从图中可知，pp*（电荷迁移）跃迁产生的谱带强度最大，ss*、np*、ns*跃迁产生的谱带强度次之，（配位跃迁的谱带强度最小）。一、有机化合物的紫外可见吸收光谱（一）、跃迁类型 基态有机化合物的价电子包括成键电子、成键电子和非键电子（以 n表示）。分子的空轨道包括反键s*轨道和反键p*轨道，因此，可能的跃迁为ss*、pp*、ns* np*等。 1. ss*跃迁 它需要的能量较高，一般发生在真空紫外光区。饱和烃中的CC键属于这类跃迁，例如乙烷的最大吸收波长max为135nm。 2. ns*跃迁 实现这类跃迁所需要的能量较高，其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区，如CH3OH和CH3NH2的ns*跃迁光谱分别为183nm和213nm。 3. pp*跃迁 它需要的能量低于*跃迁，吸收峰一般处于近紫外光区，在200 nm左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般max104，为强吸收带。如乙烯（蒸气）的最大吸收波长max为162 nm。 4. np*跃迁 这类跃迁发生在近紫外光区。它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁。其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100，属于禁阻跃迁。 5. 电荷迁移跃迁 所谓电荷迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁。因此，电荷迁移跃迁实质是一个内氧化还原的过程，而相应的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱。例如某些取代芳烃可产生这种分子内电荷迁移跃迁吸收带。电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度较大，最大波长处的摩尔吸光系数max可大于104。 （二）、常用术语 1. 生色团 从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。但是，人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。 2. 助色团 助色团是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。 3. 红移与蓝移（紫移）某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团（ -OH、 -OR、 -NH2、-SH 、-Cl、-Br、-SR、- NR2 ）之后，吸收峰的波长将向长波方向移动，这种效应称为红移效应 这种会使某化合物的最大吸收波长向长波方向移动的基团称为向红基团。 在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波长会向短波方向移动，这种效应称为蓝移（紫移）效应。这些会使某化合物的最大吸收波长向短波方向移动的基团（如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3）称为向蓝（紫）基团。 (三) 有机化合物紫外-可见吸收光谱 1. 饱和烃及其取代衍生物 饱和烃类分子中只含有s键，因此只能产生ss*跃迁，即s电子从成键轨道（ s）跃迁到反键轨道（ s*）。饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可见分光光度计的测量范围。 饱和烃的取代衍生物如卤代烃，其卤素原子上存在n电子，可产生ns*的跃迁。ns*的能量低于ss*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的ns*跃迁分别出现在173、204和258nm处。这些数据不仅说明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的吸收波长发生了红移，显示了助色团的助色作用。直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大。但是它们是测定紫外和（或）可见吸收光谱的良好溶剂。 2. 不饱和烃及共轭烯烃 在不饱和烃类分子中，除含有s键外，还含有p键，它们可以产生ss*和pp*两种跃迁。 ss*跃迁的能量小于pp*跃迁。例如，在乙烯分子中， pp*跃迁最大吸收波长为180nm。在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长， pp*跃迁的吸收带 将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。在共轭体系中，pp*跃迁产生的吸收带又称为K带。 3. 羰基化合物 羰基化合物含有C=O基团。 C=O基团主要可产生pp*、ns*、np*三个吸收带，np*吸收带又称R带，落于近紫外或紫外光区。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。由于醛酮这类物质与羧酸及羧酸的衍生物在结构上的差异，因此它们np*吸收带的光区稍有不同。 羧酸及羧酸的衍生物虽然也有np*吸收带，但是， 羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接连结含有未共用电子对的助色团，如-OH、-Cl、-OR等，由于这些助色团上的n电子与羰基双键的电子产生np*共轭，导致p*轨道的能级有所提高，但这种共轭作用并不能改变n轨道的能级，因此实现np*跃迁所需的能量变大，使np*吸收带蓝移至210nm左右。 4. 苯及其衍生物 苯有三个吸收带，它们都是由pp*跃迁引起的。E1带出现在185nm（max= 68000）； E2带出现在204nm（ max = 8800 ）；B带出现在230270nm （max= 200）。在气态或非极性溶剂中，苯及其许多同系物的B谱带有许多的精细结构，这是由于振动跃迁在基态电子上的跃迁上的叠加而引起的。在极性溶剂中，这些精细结构消失。当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带。 5. 稠环芳烃及杂环化合物 稠环芳烃，如奈、蒽、芘等，均显示苯的三个吸收带，但是与苯本身相比较，这三个吸收带均发生红移，且强度增加。随着苯环数目的增多，吸收波长红移越多，吸收强度也相应增加。当芳环上的-CH基团被氮原子取代后，则相应的氮杂环化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光谱，与相应的碳化合物极为相似，即吡啶与苯相似，喹啉与奈相似。此外，由于引入含有n电子的N原子的，这类杂环化合物还可能产生np*吸收带。常见有机化合物的生色团的紫外吸收峰，见下表： 常见有机化合物的生色团的紫外吸收峰化合物生色团lmax/ nm化合物生色团lmax/ nm烷烃-C-C-150共轭烯烃 (-C=C-)2210-230烯烃C=C170(-C=C-)3260炔烃-CC-170(-C=C-)5330酰R-C205苯 204醛R-C210255羧酸R-C200-210萘 220硝基化合物-NO270-280275亚硝基化合物-NO220-230314偶氮化合物 -N=N-285-400 二、无机化合物的紫外-可见吸收光谱 产生无机化合物紫外、可见吸收光谱的电子跃迁形式，一般分为两大类：电荷迁移跃迁和配位场跃迁。 （一）电荷迁移跃迁无机配合物有电荷迁移跃迁产生的电荷迁移吸收光谱。在配合物的中心离子和配位体中，当一个电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上时，可产生电荷迁移吸收光谱。不少过度金属离子与含生色团的试剂反应所生成的配合物以及许多水合无机离子，均可产生电荷迁移跃迁。此外，一些具有d10电子结构的过度元素形成的卤化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于这类跃迁而产生颜色。电荷迁移吸收光谱出现的波长位置，取决于电子给予体和电子接受体相应电子轨道的能量差。 （二）配位场跃迁 配位场跃迁包括d - d 跃迁和f - f 跃迁。元素周期表中第四、五周期的过度金属元素分别含有3d和4d轨道，镧系和锕系元素分别含有4f和5f轨道。在配体的存在下，过度元素五个能量相等的d轨道和镧系元素七个能量相等的f轨道分别分裂成几组能量不等的d轨道和f轨道。当它们的离子吸收光能后，低能态的d电子或f电子可以分别跃迁至高能态的d或f轨道，这两类跃迁分别称为d - d 跃迁和f - f 跃迁。由于这两类跃迁必须在配体的配位场作用下才可能发生，因此又称为配位场跃迁。三、影响紫外可见吸收光谱的影响谱带位移包括蓝移（或紫移，hypsochromic shift or blue shift)和红移(bathochromic shift or red shift)。蓝移（或紫移）指吸收峰向短波长移动，红移指吸收峰向长波长移动。吸收峰强度变化包括增色效应(hyperchromic effect)和减色效应(hypochromic effect)。前者指吸收强度增加，后者指吸收强度减小。 试样的化学环境对谱带的波长位移及强度变化有着重要的影响，其中对谱带位移产生较大影响的主要有酸度和溶剂效应。 1.酸度的影响：由于酸度的变化会使有机化合物的存在形式发生变化，从而导致谱带的位移，例如苯酚 随着pH值的增高，谱带就会红移，吸收峰分别从211 nm和270 nm位移到236 nm和287nm。又如苯胺 随着pH值的降低，谱带会蓝移，吸收峰分别从230 nm和280 nm处位移到203 nm和254 nm处。另外酸度的变化还会影响到络合平衡，从而造成有色络合物的组成发生变化，而使得吸收带发生位移，例如Fe (III) 与磺基水杨酸的络合物，在不同pH时会形成不同的络合比，从而产生紫红、橙红、黄色等不同颜色的络合物。2. 溶剂对紫外可见吸收光谱的影响 溶剂对紫外可见光谱的影响较为复杂。改变溶剂的极性，会引起吸收带形状的变化。例如，当溶剂的极性由非极性改变到极性时，精细结构消失，吸收带变向平滑。改变溶剂的极性，还会使吸收带的最大吸收波长发生变化。下表为溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。 名称正己烷CHCl3 CH3OHH2Opp* max/nm 230238237243n p*max/nm329315309305 由上表可以看出，当溶剂的极性增大时，由n p*跃迁产生的吸收带发生蓝移，而由pp* 跃迁产生的吸收带发生红移。因此，在测定紫外、可见吸收光谱时，应注明在何种溶剂中测定。 由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。选择溶剂时注意下列几点： （1）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的。即所成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。 （2）在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。（3） 溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。 第三节 光的吸收定律朗伯-比耳定律 一、透射比和吸光度 当一束平行光通过均匀的溶液介质时，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则 在进行吸收光谱分析中，被测溶液和参比溶液是分别放在同样材料及厚度的两个吸收池中，让强度同为I0的单色光分别通过两个吸收池，用参比池调节仪器的零吸收点，再测量被测量溶液的透射光强度，所以反射光的影响可以从参比溶液中消除，则上式可简写为 透射光强度(It)与入射光强度(I0)之比称为透射比(亦称透射率)，用T表示，则有: 溶液的T越大，表明它对光的吸收越弱；反之，T越小，表明它对光的吸收越强。为了更明确地表明溶液的吸光强弱与表达物理量的相应关系，常用吸光度(A)表示物质对光的吸收程度，其定义为: 则A值越大，表明物质对光吸收越强。T及A都是表示物质对光吸收程度的一种量度，透射比常以百分率表示，称为百分透射比，T；吸光度A为一个无因次的量，两者可通过上式互相换算。 二、朗伯-比耳定律 朗伯比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸光物质的浓度c及吸收介质厚度l(吸收光程)的函数。朗伯和比耳分别于1760年和1852年研究了这三者的定量关系。朗伯的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定浓度的均匀溶液时，A与l成正比，其数学式为: A = kl (此即称为朗伯定律，k为比例系数 ) 而比耳的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定液层厚度的均匀溶液时，A与c成正比，其数学表达式为: (此即称为比耳定律，k称为比例系数) 合并上述k的数值取决于吸光物质的特性外，其单位及数值还与c和l所采用的单位有关。l通常采用cm为单位，并用b表示。所以k的单位取决c采用的单位。 当c采用重量单位g/L时，吸收定律表达为: (a称为吸光系数，单位为) 当c采用摩尔浓度mol/L时，吸收定律表达为: (称摩尔吸光系数，单位为) 当一束平行光通过均匀的溶液介质时，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。设入射光强度为I0，透射光强度为It，溶液的浓度为c，液层的宽度为b，根据朗伯比尔定律可知他们之间有下列关系，则图9-3 辐射吸收示意图A称为吸光度（absorbance），吸收度或光密度（OD，optical density），a称为吸收系数(absorotiviry)，是化合物分子的特性，它与浓度（c）和光透过介质的厚度（b）无关。当c为摩尔浓度，b以厘米为单位，a即以来表示，称为摩尔吸光系数或摩尔消光系数（molar absorptivity）。 如何将朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律用于紫外-可见分光光度法？课堂讨论按朗伯-比耳Lambert-Beer定律可进行定量测定。测量时盛溶液的吸收池厚度为b，若浓度c已知，测得吸光度A即可计算出值，即为化合物的物理常数。若已知值，则由测得的吸光度可计算溶液的浓度。由上述可见，当测定一个化合物的吸收光谱时，被吸收光的波长和摩尔吸光系数的两个重要的参数，前者表示吸收能量的大小，后者反映能级跃迁的几率，属于化合物的特性。3、 偏离光吸收定律的因素定量分析时通常也曾厚度是相同的，按照朗伯比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性二发生弯曲。若在弯曲部分进行定量，将产生较大的测定误差。1. 物理因素 朗伯比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但在实际工作中，即使质量较好的分光光度计所得的入射光，荣然具有一定波长范围的波带宽度。在这种情况下，吸光度与浓度并不完全呈线性关系，因而导致朗伯比尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离越小入射光不存或杂散光等的影响；非吸收作用引起的对朗伯比尔定律的偏离，主要有散射效应和荧光效应，一般情况下荧光效应对分光光度法产生影响较小。朗伯比尔定律只只适应于十分均匀的吸收体系。当待测液的体系不是很均匀时，入射光通过待测液后将产生光的散射而损失，导致吸收体系的透过率减小，造成实测吸光值增加。朗伯比尔定律是建立在均匀、非散射的溶液的基础上的。如果戒指不均匀，呈交替、乳浊、悬浮状态，则入射光除了被吸收外，还会有反射、散射的损失，因而实际测得的吸光度增大，导致对朗伯比尔定律的偏离；当入射光透过待测液，若吸光物质分子吸收辐射能后所产生的激发态分子以发射辐射能的方式回到基态而发射荧光，结果必然使待测液的透光率相对增大，造成实测吸光值减小。2. 化学因素溶质的理解、算效应、溶剂作用等会引起朗伯比尔定律的偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯比尔定律的主要化学因素。溶液稀释时，上述平衡向右，理解度增大。（1） 离解作用。在可见光区域的分析中常常是将待测组分同某种试剂反应成有色配合物来进行测定的。有色配合物在水中不可避免的要发生离解，从而使得有色配合物的浓度要小于待测组分的浓度，导致对吸收定律的偏离。特别是对于稀溶液而言，更是如此。（2） 酸效应。如果待测组分包括在一种酸碱平衡体系中，溶液的酸度将会使得待测组分的存在形式发生变化，二导致对吸光定律的偏离。（3） 溶剂作用。溶剂对吸收光谱的影响是比较大的，溶剂不同时，物质的自首光谱也不同。4、 吸光度的加和性如果溶液中含有几种有几种彼此之间不相互作用的组分，他们对某一波长的光都产生吸收，那么该溶液对该波长总吸收等于溶液中几种组分的吸光度之和，就也就是说吸光度具有加和性，也可表示为： A总=A1+A2+A3+An=1c1b+2c2b+3c3b+ncnb =（1c1+2c2+3c3+ncn)b 吸光度的加和性对多组分同时定量测定，校正干扰等都有很大用处。 第4节 紫外-可见分光光度计 1854年，杜包斯克（Duboscq）和奈斯勒（Nessler）等人将分光光度法应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度也不断提高，其应用范围也不断扩大。分光光度计自生产到目前为止，得到了很大的发展，类型也很多。国产分光光度计近十年来已有了很大的发展，各种档次的分光光度计都已更新升级换代，可见光系列有：721、722、723等型号，紫外可见光系列有：751、752、753、UV-1800、UV-1801等型号，主要生产厂为上海分析仪器总厂等。 一、仪器部件介绍紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统。其工作原理如图9-4所示。光源单色器吸收池检测器信号显示、记录装置 图9-4 分光光度计工作原理图 1. 光源 对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。 热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。钨灯和碘钨灯可使用的范围在340 2500nm。这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光区，辐射的能量与工作电压4次方成正比。光电流与灯丝电压的n次方（n1）成正比。因此必须严格控制灯丝电压，仪器必须配有稳压装置。在近紫外区测定时常用氢灯和氘灯。它们可在160 375 nm范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大35倍。2. 单色器单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度度、选择性及校准曲线的线性关系等。 能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。 棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光域。 光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。入射、出射狭缝，透镜及准光镜等光学元件中狭缝在决定单色器性能上起重要作用。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。3. 吸收池 吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。紫外光谱仪吸收池恰好安排在光电转换前。4. 检测器 检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。 硒光电池对光的敏感范围为300800nm，其中又以500 600nm最为灵敏。这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。 光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。 光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。5. 信号指示系统 它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。二、仪器的分类分光光度计可分为三种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。 1. 单光束分光光度计 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。国产722型、751 型、724型、英国SP500型以及Backman DU-8型等均属于此类光度计。图6 单光束分光光度计原理图 2. 双光束分光光度计 经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。这类仪器有国产710型、730型、740型等。图6 单波长双光束分光光度计原理图 3. 双波长分光光度计由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值AA=A(1)-A(2)。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。 图7 双波长分光光度计光路示意图 三、实验室常用仪器1. 721型可见分光光度计721型可见分光光度计是在72基础上改进而成的，他的结构比72型合理，性能比72型亦有显著提高，工作波段为360800nm，用钨丝白炽灯作光源，棱镜做单色器，采用自准式光路，用CD-7型真空光电管作为光电转换原件，以场效应管作放大器，可测微弱的光电流变化，用微安表作为读书器。仪器有较高的灵敏度。2. 722型可见分光光度计与721型可见分光光度计相比，722型可见分光光度计不再用指针指示读数，变为数字显示的。对旋钮进行了改造。也可直接读出浓度c。3. 751型紫外-可见分光光度计751型紫外可见分光光度计是一种波长范围较宽（2001000nm）、精确度较高的分光光度计。不仅用于可见光区，也能用于紫外及近红外光区的分析。由光源（钨丝灯或氢灯）发出的光线由反射镜反射，是光线经狭缝的下半部和准光镜进入单色器，经棱镜色散后，由准光镜将光聚焦与狭缝上半部而射出，经液槽照射于光电管上。由此可见，次一起用同一狭缝作为如光和出光狭缝，他们始终具有相同的宽度。棱镜和透镜均用石英材料制成，反光镜和准光镜表面镀铝。所以全部系统保证紫外光谱通过。波长范围在200320nm范围用氢灯作光源；波长在3201000nm范围用钨丝灯作光源。波长在200625nm用蓝敏光电管接收透射光。波长在6251000nm用红敏光电管接收透射光。吸光度和透光率刻在电位差计转盘上，而电流计启示零作用。4. 9200型紫外-可见分光光度计 性能优良，适应。数字显示，触摸显示，触摸式键，进行浓度c直读，可与打印机连接。5. 9600型紫外-可见分光光度计性能优良，适应。数字显示，触摸显示，触摸式键，可做多条浓度曲线，从而选择后进行浓度直读，同时，也可与打印机连接。6. 1201型紫外-可见分光光度计用电脑来进行控制仪器，我们需要做的工作就是放样品。可以进行光谱扫描、定量、定性分析。对数据的而处理可以通过软件来进行。7. T6型紫外-可见分光光度计 杂散光低、稳定性出色、软件灵活升级；人性化的整体设计，可针对各行各业定制的测量软件包；，电脑操作，方法简单。8. UV-1801型紫外-可见分光光度计 波长范围宽，5nm、2nm、1nm、三种光谱带宽可满足药典的严格要求；手动宽大四连池；测量方法丰富，具有波长扫描、时间扫描、多波长测定、多阶导数测定（选）、双波长（选）、三波长（选），DNA蛋白质测量（选）等多种测量方法，可满足不同测量的要求；同时，电脑操作，方法简单。9. UV-1800型紫外-可见分光光度计优良的光学性能、低杂散光、稳定性高、噪音低；样品室可拆卸不、光源室开放式。同时，用电脑来进行控制仪器，我们需要做的工作就是放样品。可以进行光谱扫描、定量、定性分析。对数据的而处理可以通过软件来进行 以上仪器可供物理、化学、医学、生物学等学科进行科研或供化学工业、食品工业。制药工业、冶金工业网、环境保护部门进行各种无知己的定性、定量分析。 第5节 紫外-可见分光光度法分析条件的选择 利用紫外可见分光光度法进行分析，条件的选择会直接影响到实验效果。所以选择合适的实验条件是一项十分重要的实验技术。一、溶剂选择原则 （1）不与被测组分发生化学反应。 （2）所选溶剂在测定波长范围内无明显吸收。 （3）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的，即所成溶液应具有良好的化学和光学稳定性。 （4）在溶解允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。（见第二节） （5）被测组分在所选的溶剂中有较好的峰形。二、测量条件的选择选择适当的测量条件，是获得准确测定结果的重要途径。选择合适的测量条件，可以从下列几个方面考虑。 1. 入射波长的选择 通常是根据北侧组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰进行测定；或者是有干扰时，则选用灵敏度较低但能避免干扰的入射光，就能获得满意的测定结果。2.狭缝宽度的选择为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的1/10。3. 吸光度测定范围的选择在不同吸光度范围内读数会引起不同程度的误差，为提高测定准确度，硬选择最适宜的吸光度范围进行测定。任何类型的分光光度计都有一定的误差，但对于一台分光光度计来说，透光率读数误差T是一常数（约为0.2%2%）。但透光率误差并不能代表结果误差，测定结果误差常用c/c表示。 由朗伯比尔定律可知 A=-lgT=bc将上式微分整理可得 要使测定的相对误差c/c最小，求导取极小得出：当T=0.368（A=0.434）时，c/c最小（为1.4%），假设T=0.5%，将其带入上式，则可计算出不同透光率时浓度相对误差c/c，如下表所示。不同透光率时浓度相对误差见下表：T/%Ac/c/%T/%Ac/c/%950.02210.2400.3991.36900.0465.3300.5231.38800.0972.8200.6991.55700.1552.0101.0002.17600.2221.6331.5234.75500.3011.4421.6996.38 由上表可以看出浓度相对误差的大小与透光率读数范围有关。当所测吸光度在0.151.00的范围内时，浓度测量误差为1.4%2.2%，测量的吸光度过低或过高，误差都是非常的，因此普通分光光度计不适于高含量或极低含量物质的测定，一般最适宜的测量范围为0.20.8之间。实际工作中，可以通过调节北侧溶液的浓度，使其在适宜的吸光度范围。为此，可以从以下两个方面考虑：计算而且控制试样的称出量，含量高时，少取样或稀释试液；含量低时，可多取样或萃取富集；如果溶液已显色，则可通过改变吸收池的厚度来调节吸光度的大小。4. 参壁溶液的选择测定试样溶液的吸光度，需先用残壁溶液调节透光率为100%（或吸光度值为0），以消除其他成分及吸光吃和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。残壁溶液是用于调节仪器工作零点的，若选择不适当，对测量读数准确度和影响较大参比溶液的选择视分析体系而定，选择的方法是：（1）溶剂参比。试样简单、共存其他成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素。（2）试样参比。如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件处理试样，只是补加入显色剂。（3） 试剂参比。如果缴入试剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。（4） 平行曹锁参比。用不含北侧组分的试样，在相同条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。此外，对吸收池厚度、透光率、仪器波长、读数刻度等应进行校正。三、反应条件的选择在分光光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的化学反应叫显色反应。显色反应可分为两大类，配位反应和氧化还原反应，而配位反应是最主要的显色反应。与被测组分化合车固有色物质的试剂称为显色剂。同一被测组分常可与若干种显色剂反应，生成多种有色化合物，其原理和灵敏度亦有差别。一种北侧组分究竟应该用哪种显色反应，可根据所需标准加以选择。（1） 显色剂的选择 1.选择性好所用的显色剂仅与被测组分显色，而与其他共存组分不显色，或者其他组分干扰容易被消除，或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远。2. 灵敏度要足够高灵敏度高的显色反应有利于微量组分的测定。灵敏度的高低，可由摩尔吸光系数值得大小来判定。摩尔吸光系数值越大，灵敏度越高。但应注意，灵敏度高的显色反应，并不一定选择性好；对于搞含量的组分，不一定要选用灵敏度高的显色反应。3. 有色配合物的组成要恒定显色剂与被测物质的反应要定量进行，生成有色配合物的组成要恒定。化学性质要稳定，有色化合物的组成若不符合一定的化学式，测定的再现性就差。4. 生成的有色配合物稳定性好生成的有色配合物稳定性要好，既要求配合物有较大的稳定常数，有色配合物不易受外界环境的影响，亦不受溶液中其他化学因素的影响。有较好的重现性，结果才准确。5. 色差大有色配合物与显色剂之间的颜色差别要大，试样试剂空白小，显色时颜色变化才明显。通常把两种有色物质最大吸收波长之差称为“比色度”。一般要求有色配合物与显色剂之间的对比度在60nm以上。6. 显色反应的条件要易于控制如果条件要求过于苛刻，难以控制，测定结果的再现性就差。显色剂一般分为无机显色剂和有机显色剂两大类。许多无机显色剂能与金属离子起显色反应，如Cu