离子对试剂.doc

离子对试剂介绍离子对试剂的优点在过去，带电荷分析物的色谱分离通过离子抑制（小心调节流动相PH值以使分析物非离子化）来达到。然而，要确定离子抑制状态下的最佳流动相PH值，却往往需要额外的摸索过程。含有一个以上的可离子化成分的样品，通常是不稳定的。离子抑制的局限性导致了一种新的、更普遍适用的方法进行可离子化物质色谱分离的方法：离子对色谱。离子对色谱由Gordon Schill博士于1973年建立，其方法是将离子性化合物添加到流动相中以促使离子与带电荷分析物形成配对离子。这些试剂由带有可离子化终端的烷基链组成。当在反相条件下用于常见的憎水性HPLC固定相时，离子对试剂可选择性的增加带电荷分析物的保留时间。尽管离子交换色谱已经成为常见的分离模式，它并非在所有情况下都起作用。较离子交换色谱，离子对色谱的优点在于： 缓冲液制备简单； 碳链长度选择众多，可用于增加保留时间、改善分离性质； 显著缩短分离时间； 同时分离离子化和非离子化分析物； 分析结果重现性极好； 改善峰形。Regis提供的离子对试剂Regis生产超纯的阴离子磺酸盐（S-系列）和阳离子季胺（Q-系列）离子对浓缩液，碳链长度有：戊、己、庚、辛和月桂(十二)。在我们的产品命名中，碳链长度以红色数字标出，如：5，6，7，8和12。纯度是关键因素在我们生产离子对试剂的过程中，纯度是非常重要的质量标准。Regis S-和Q-系列离子对试剂根据工业最高质量标准进行合成，从而得到超乎寻常的纯度。这一点可参见表1：在波长低至200nm时对于Regis S-和Q-系列离子对试剂均可达到紫外透过性。在大部分情况下，这些紫外吸收值要低于用于HPLC梯度洗脱的乙腈和甲醇的紫外吸收值。尽管S-和Q-系列离子对试剂能在低于210nm的波长下使用，决定使用什么波长的关键因素还是在于检测器镜片和有机该性剂（如甲醇等）的综合情况。Regis还提供批量磺酸盐和几种补充批量离子对试剂以及Rivier缓冲剂以补充磺酸盐S-系列和季胺Q-系列的分离能力。如何为分析方法的建立选择合适的Regis离子对试剂要选择合适的试剂，必须考虑烷烃长度。不同的烷烃链长度使得能够选择性分离分析物。链越长，离子对的憎水性越强，从而，保留时间也就越长。当链长度由戊基(Q5)增加到月桂基(Q12)时，保留因子几乎增长了20倍，如表2和表3所示。表2和表3中的数据显示出Q-试剂链长度决定了苯甲酸的保留时间，但不会影响到苯甲醇的保留时间。对于S-系列试剂也可以观察到类似的选择性。以下是使用Regis离子对试剂来成功建立分析方法的指导：1. 选择一根色谱柱，常为C18柱；2. 准备流动相时仅使用HPLC级别的水和色谱级试剂；3. 选择能给出最佳分离度的流动相成分和浓度；4. 如果样品中有非离子化物质，在尝试离子化分离之前首先优化分离情况；5. 选择合适的离子对系列试剂以提供相应的离子配对：对于酸性分析物使用Q-系列离子对试剂；对于碱性分析物使用S-系列离子对试剂；6. 通过比较选择所得分离度最好的离子对试剂；7. 一旦离子对试剂已经确定，调节流动相的pH值将分离度最大化；因为微小的pH值改变对保留性质和选择性都有较大的影响，所以仔细小心的小幅度调节pH值（参见表3）；8. 理想状况下，流动相中的离子对试剂浓度应为0.005M，但是稍微增加离子对试剂可能会稍微增加保留性质并因此优化分离情况。2.2 高效液相色谱分离 HPLC-ICP-MS联用技术在元素化学形态分析中的应用，已有文献总结；该技术的优点是应用范围广。以下是几种常用于形态分析的HPLC技术。2.2.1 体积排阻色谱(SEC) SEC是按溶质的分子大小来分离的。其优点是：未知分子质量的样品在末端时间或在此之前淋出，因而可以预测色谱运行的终点；未知物的分子质量可以用校正的色谱系统来表征。SEC通常不会引起元素形态的丢失，适用于不稳定或与金属络合较弱的生物大分子。缺点是容量有限，不能分辨多组分样品，仅能分离分子大小不同且不能吸附在柱上的分析物。此外，有些化合物的保留时间会迁移至淋洗体积的末端以外，有时还会产生吸附效应和憎水效应，这些现象均会导致化学形态的转变和破坏。2.2.2 离子交换色谱(IEC) 与SEC相比，IEC最主要的优点是分离效率高，应用范围广。分离过程基于带电溶质离子与固定相的反电荷表面的交换平衡。溶质离子与流动相中的等电荷离子竞争固定相上的反离子。这种竞争决定了离子的相对保留时间，它依赖于流动相的pH值、离子强度和离子交换剂的性质。淋洗液中如含有高浓度的盐类，将会影响与ICP-MS的接口。 此外不稳定的金属-蛋白的络合物中的金属会被缓冲液中的金属所代替。所以，IEC经常应用于以共价键结合的硒氨基酸或砷化合物。2.2.3 反相高效液相色谱(RP-HPLC) RP-HPLC利用极性较流动相弱的固定相来分离分析物。保留机制是基于分析物的憎水性。该方法的应用范围广，对不同形态的分辨率高，重复性好。但是，固定相有离子交换性质，在pH4时碱性分析物在柱上的吸附力很强。一般应用两种不同的淋洗液，其中至少有一种含有相当量的有机改进剂。淋洗生物分子需要用有机溶剂，还经常需要用酸。有机溶剂和酸很容易改变形态如蛋白-金属络合物。蛋白质被打开后，释放的金属即与其它络合剂结合导致形态改变。所以，RP-HPLC适用于分离以共价键结合的金属络合物而不适用于不稳定的金属络合物。2.2.4 离子对色谱(IP-RPLC) RP-HPLC仅能分离非极性不带电的分析物。在分离带电的极性分析物时需要用离子对试剂。固定相是标准硅烷化的硅胶填料(如C8或C18。)，流动相是由如磷酸盐或醋酸盐、有机改进剂(甲醇或乙腈)和离子对试剂组成的水溶液缓冲体系。离子对试剂与分析物生成离子对保留在反相柱上。离子对试剂参与流动相中分析物与非极性固定相之间的平衡。在考虑离子对试剂时应尽量用溶于流动相的去质子的一价反离子，并对色谱柱和分析物不造成损害。用缓冲溶液控制水相的pH值和反离子的浓度以避免峰拖尾和出现多峰至关重要。与RP-HPLC相比，IR-RPLC的优点是方法的灵活性和多样性增加了。可以为一种特定的要求来设计分离条件。但是，方法所用的有机溶剂和酸也会影响元素的形态。离子对试剂更加重了这些问题，于是对分析物的稳定性的要求比单独使用RP-HPLC更高。一、离子对试剂的定义：离子对试剂是由强亲水离子形成，反作用于样品分子的中性离子对。因此，可用于同时分离带电分子和非带电分子。 二、适用范围：一般可适用所有色谱固定相，流动相至少含用乙腈的情况下）。当使用长链的离子对试剂时，如：十六烷基硫酸铵或十二烷基硫酸钠，色谱柱将选用反相色谱柱。 三、使用浓度：离子对试剂的适用浓度短链离子对试剂：510-3mol/L 长链离子对试剂：510-4mol/L使用液相色谱法分析电离能力比较强的样品时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂，将分析物上的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子。就像是一个物质要穿色谱柱而过时，我们使用离子对试剂将它留住。 离子对试剂是在高效液相色谱法中引入了离子色谱方法的一种表现。它主要是作用于样品和固定相之间的一种物质，所以在选择离子对试剂时，要考虑色谱柱的调料盒样品的酸碱性。离子对试剂的种类和浓度对分离效果都有较大的影响.离子对试剂种类的选择依赖于被分离样品的性质.被分离溶质是强酸或强碱,离子对试剂可以是强酸或强碱,弱碱或强酸,弱酸,如被分离的溶质是弱酸或弱碱,则选用的离子对试剂必须是强碱或强酸.对于溶质结构性质相差较大的混合样品,离子对试剂种类的选择并没有特殊要求.离子对试剂疏水性的差别可以通过调节离子对试剂浓度和有机溶剂浓度获得满意的分离效果。离子对试剂用于高压液相离子对萃取的液相色谱法分离分析强极性有机酸和有机碱的好方法。广泛应用于生物化学，药物学，和石油化工等领域。 一、用于酸性化合物 1、四丁基氢氧化铵（10%水溶液） 2、四丁基溴化铵 3、十二烷基三甲基氯化铵 二、用于碱性化合物 1、戊烷磺酸钠 2、己烷磺酸钠 3、庚烷磺酸钠 4、辛烷磺酸钠 5、癸烷磺酸钠 离子对试剂是高效液相色谱专用试剂，主要分析测试有机碱类离子化合物，代替离子交换法，具有可靠的分离效果。也可用于分析多肽和蛋白质，是制备抗静电聚脂纤维的中间体. 常用离子对试剂 1-戊烷磺酸钠 CAS:22767-49-3 1-己烷磺酸钠 CAS:2832-45-3 1-庚烷磺酸钠 CAS:22767-50-6 1-辛烷磺酸钠 CAS:5324-84-5 1-癸烷磺酸钠 CAS:13419-61-91. 选择一根适合的色谱柱，常为C18柱； 2.准备流动相时仅使用HPLC级别的水和色谱级试剂； 3.选择能给出最佳分离度的流动相成分和浓度； 4.如果样品中有非离子化物质，在尝试离子化分离之前首先优化分离情况； 5.选择合适的离子对系列试剂以提供相应的离子配对：对于酸性分析物使用酸性离子对试剂；对于碱性分析物使用碱性离子对试剂； 6.通过比较选择所得分离度最好的离子对试剂； 7.一旦离子对试剂已经确定，调节流动相的pH值将分离度最大化；因为微小的pH值改变对保留性质和选择性都有较大的影响，所以仔细小心的小幅度调节pH值（参见表3）； 8.理想状况下，流动相中的离子对试剂浓度应为0.005M，但是稍微增加离子对试剂可能会稍微增加保留性质并因此优化分离情况。在过去，带电荷分析物的色谱分离通过离子抑制（小心调节流动相PH值以使分析物非离子化）来达到。然而，要确定离子抑制状态下的最佳流动相PH值，却往往需要额外的摸索过程。含有一个以上的可离子化成分的样品，通常是不稳定的。离子抑制的局限性导致了一种新的、更普遍适用的方法进行可离子化物质色谱分离的方法：离子对色谱。 离子对色谱由Gordon Schill博士于1973年建立，其方法是将离子性化合物添加到流动相中以促使离子与带电荷分析物形成配对离子。这些试剂由带有可离子化终端的烷基链组成。当在反相条件下用于常见的憎水性HPLC固定相时，离子对试剂可选择性的增加带电荷分析物的保留时间。 尽管离子交换色谱已经成为常见的分离模式，它并非在所有情况下都起作用。较离子交换色谱，离子对色谱的优点在于： 缓冲液制备简单； 碳链长度选择众多，可用于增加保留时间、改善分离性质； 显著缩短分离时间； 同时分离离子化和非离子化分析物； 有效改善峰形对色谱柱伤害较大。离子对试剂会对色谱柱造成不可逆的伤害，离子对试剂和固定相结合产生不可逆吸附，进而影响固定相活性位点。比如十八烷基硅胶键合色谱柱，离子对试剂会影响色谱柱键合，从而达到分析样品的作用。这种反应对色谱柱影响很大，而且离子对试剂很难从色谱柱上冲洗干净，会大大缩短色谱柱的使用寿命。 实验条件不稳定。离子对试剂的浓度与其样品的保留时间有直接的影响，而且离子对试剂对pH值比较敏感，配制流动相时要求精确度较高。否则直接影响实验的重复性和重现性1、作用原理 “加入离子对试剂后，它可以与待分析的物质（多为在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，这样非极性就表现出来，从而在色谱柱上有保留行为。” 我觉得离子对试剂很像胶黏剂，一头以离子吸引住待测物（也是离子），另一头以碳链与固定性作用，从而把待测物保持在固定相上 。它的优点和缺点，都是因为这样的特性。2、试剂选择 “离子对分为正离子对和负离子对，分析酸性样品（确切的说应该是作用基团）用正离子对试剂，分析碱性样品用负离子对试剂。 正离子对试剂可以吸附带负电荷的样品组分，负离子对试剂反之。戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠十二烷基磺酸钠都属于负离子对试剂；四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵一类属于正离子对试剂。 离子对要考虑样品体系的复杂性和干扰物的特性，先用原则一般尽可能使用碳链短的先，这样可以避免强保留造成对柱子效能的影响，同时，浓度尽可能的低，以保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。” 看来做实验下手轻点儿好，从碳链短的开始，从低浓度开始，不行再慢慢加。不过这次的使用经验是从碳链长度中等的开始，可以更快看到效果，节约摸索分析条件的时间。同时流动相PH值尽可能低以确保离子化程度。3、试剂的使用 “离子对试剂不一定是表面活性剂，如己烷和庚烷磺酸钠，又如三乙胺活四丁基溴化胺，不具表面活性作用。所以用己烷和庚烷盐就没有泡末，用四丁基溴化胺也不产生气泡。十二烷基磺酸钠（或硫酸钠），或者十六烷基溴化钠（CTAB,一种做阴离子用的阳性表面活性剂），在浓度高的时候容易产上泡末。做HPLC时流动相里加的SDS或CTAB浓度一般不会太高，一般在0.1%以下，而且流动相里有甲醇等有机溶剂，高浓度的有机溶剂有破乳的作用，因此，混合后的流动相泡末应该不会很多。另外，做电泳加入的SDS量很大的比如做蛋白质SDS胶，或者毛细管电泳里的MECC，SDS浓度很高，而且没有或者有很少比例的有机改性剂，当然会有气泡，跟HPLC不完全相同。”达人们的意思我看明白了，就是有点泡沫不要怕，确保溶液摇匀就好。使用离子对试剂时，调节保留时间的方式与普通反相不同，变化有机相比例没有改变PH值来得有效。 “当流动相PH值较高时，样品以中性形式存在，那么正电荷较少，相应的保留较弱；当流动相PH值较低时，样品便以质子碱H+形式的离子状态存在，那么正电荷与固定相上带负电荷的-SO3强烈吸附，相应的保留会非常强。” “再说明一下B物质的pKa，其值为10.5，在pH为4.5、3.8时都以离子态存在，这点没错，虽然都是离子态，都是99%以上，但从量上说还是有点不一样的。任何物质以离子态存在时都有一个平衡的状态：B（H）（BH），这里存在着一个平衡常数K（或者说离解常数），于是pH不同时，H不同，对应的B、BH也不同。所以才会出现pH不同，保留值会不同。 另外我认为4.5和3.8的pH相差不大，其改变对物质的保留值影响不会很大，因为在流动相中还受到很多因素的影响。”4、使用后清洗 大家都强调离子对试剂要冲洗较长时间才能洗去。想想也知道那简直是一定的，使用前平衡了老半天呢，要是轻易就能洗去就怪了。 对于多数离子对试剂，清洗还是比较简单