植物生物技术本科生研讨课第三讲唐克轩20100314.ppt

植物生物技术 过去 现在和未来PlantBiotechnology past current futureprospectsKexuanTang 唐克轩 SchoolofAgricultureandBiologyPlantBiotechnologyResearchCenterFudan SJTU NottinghamPlantBiotechnologyR DCenterShanghaiJiaotongUniversityTelandFax 34206916Email kxtang orkxtang1 内容 Content 生物技术的发展及内涵 ThehistoryofBiotechnology 基因克隆 Genecloning 转基因植物 Transgenicplant 植物生物反应器 PlantBioreactor 植物代谢工程 PlantmetabolicEngineering 参观实验室 Visitinglaboratory 转基因植物 我们生活的地球是一个千姿百态的世界 与我们共同生活的生物约有1000万种 包括花鸟虫鱼 飞禽走兽 其中植物是我们赖以生存的最重要食物来源并将我们的生活环境装扮得五彩缤纷 果分酸甜 有长有圆 有土中生的有树上长的 花分大小 有红有黄 是什么魔力在起作用 基因 转基因植物 什么是基因和转基因植物 基因 Gene 是位于染色体上的念珠状DNA分子 它通过编码和控制蛋白的合成 直接参与生物形态形成 形成千姿百态的世界 植物也和我们人类一样 会生病 知饥渴 有时还要遭受害虫的袭击 有些逆境是植物本身能够忍受的 有些是无法克服的 人类为了使它们生活得更好 为了我们得到足够和更为精美的食物 我们需要对它们进行改造 目前 我们采取包括转基因在内的各种手段 帮助它们对抗不利的环境 转基因植物 什么是基因和转基因植物 所谓的转基因植物就是将某一特定功能的基因 抗病 抗虫等 从DNA分子上切割下来 装在运输工具 DNA载体 上 导入植物体内 并使该基因在植物体内稳定遗传 表达出特定的蛋白质 赋予植物以新的特性 如果 这个基因编码的蛋白具有杀虫能力 那么它们转移到玉米的细胞中 玉米就具有了抗虫性 这种通过基因转移植入了新基因的植物叫做转基因植物 Geneticallymodifiedplant 转基因技术主要用于提高植物抗逆 抗冻 耐干旱等 抗病害 抗虫害能力 改善营养品质和生产用于治疗和预防人类疾病的生物药等 目前转基因已在35科120多种植物上获得成功 植物遗传转化 植物转化载体的构建一 植物基因工程载体的种类和特征将目的基因向受体植物转化是植物基因工程的关键步骤之一 近年来建立起来的高等植物基因遗传转化的方法很多 但是归纳起来有不外乎2种 一种是非生物载体介导的遗传转化另一种是生物载体介导的遗传转化 就非生物载体转化而言 该系统又可以分为两种类型 种质转化系统和直接转化系统 种质转化系统 以植物自身的生殖系统种质细胞 如花粉粒或其他细胞等为媒体的转化系统直接转化系统 采用物理化学方法直接将外源基因导入受体细胞 如基因枪法 脂质体法 超声波法等 生物载体介导的遗传转化根据载体的不同可以分为病毒载体和质粒载体介导的遗传转化 作为植物基因转化的载体 必须具有两种功能 一是它能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去 并且整合到宿主细胞的基因组DNA上 二是它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列 即启动子和复制子起始位点 以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达 1 病毒载体以植物病毒作为植物基因工程的克隆载体有以下优点 第一 植物病毒载体能把外源基因直接导入植物细胞 并且系统地分布到整个植株 而无需经过从原生质体再生植株的过程 简化了植物基因工程中外源基因的传递过程 第二 由于病毒具有较高的自我复制能力 在转化植物中可以得到高拷贝的外源基因 有利于外源基因的表达和功能的实现 第三 植物病毒载体感染植物以后 病毒载体的DNA一般不整合到植物细胞核DNA上 不影响植物基因组的其它功能基因的表达 缺陷 第一 病毒载体不能把携带的外源基因整合到寄主染色体上 不能按孟德尔规律传递给后代 第二 病毒载体仍然存在致病的可能性 可能会诱发植物产生病害 第三 由于病毒载体本身的不稳定性 病毒载体中的外源基因很容易丢失 2 质粒载体有一种土壤细菌 称为农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 它能诱导植物伤口形成冠瘿瘤 Crowngall 细菌的致瘤能力来源于细菌内的一个额外染色体 即质粒 plasmid 称Ti质粒 还有一种细菌称发根农杆菌 决定毛根症的质粒为Ri质粒 即诱发寄主植物产生毛状根 Ti和Ri质粒是理想的基因克隆载体 通过它们可以将外源的DNA转移到植物细胞 并再生出能够表达外源基因的转基因植物 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质 为双股共价闭合的环状DNA分子 约有150 200kb大小 在病原菌致病过程中 其中的一段DNA分子 T DNA 能够插入到植物基因组中并能够稳定表达 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同 Ti质粒可以被分成四种类型 章鱼碱型 octopine 图 胭脂碱型 nopaline 农杆碱型 agropine 和农杆菌素碱型 agrocinoine 或称琥珀碱型 succinamopine 二 根癌农杆菌Ti质粒 章鱼碱型Ti质粒结构示意图 Agrobacteriumtumefaciensinfectionresults tumors poorgrowth lowyield Ti质粒的结构各种不同类型的Ti质粒都具有T DNA区 毒性区 质粒复制起点 质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点 图9 2 其中以T DNA区和毒性区在植物转化中最为重要 1 T DNA区 transfer DNAregions T DNA是农杆菌侵染植物细胞时 从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA 故称之为转移DNA T DNA两端各有一段25bp的重复序列 分别称为左边界序列和右边界序列 T DNA携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的基因 T DNA两端的重复序列对T DNA转移到植物细胞内具有重要意义 保留T DNA两端的末端序列 然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T DNA的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去 从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力 设计出具有非致瘤性的所谓卸甲载体 disarmedvector 把我们所需的外源目的基因引入这种载体 就可以较容易地得到这种目的基因的完整转基因植株 2 Vir区Vir区段上的基因与T DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关 区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性 故称之为毒性区 Vir区段总长度大约35kb 由7个互补群组成 分别命名为VirA VirB VirC VirD VirE VirG和VirH 毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种 一种是组成性表达 即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平 另一种是植物诱导性表达 即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时 植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达 VirA是属于第一种情况的位点 VirB VirC VirD和VirE是属于第二种情况的位点 研究发现 乙酰丁香酮及羟基乙酰丁香酮等可作为信号分子刺激T DNA的转移 Vir区中各个基因之间都是相互联系相互影响的 缺一不可 当Vir基因与T DNA分别位于两个不同的复制子上时 即Vir区与T DNA区分割开来以后 Vir基因仍然能够为T DNA提供转移功能 这个特性对植物遗传转化非常重要 3 Con区 regionsencodingconjugations 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因 tra 调控Ti质粒在农杆菌之间的转移 4 Ori区 originofreplication 该区段基因调控Ti质粒的自我复制 故称之为复制起始区 2 T DNA转移的机制T DNA的转移与整合需要vir基因 virA virB VirG virC virD和virE 编码产物的参与 除了这些Ti质粒编码的基因之外 还已鉴定出一些位于根瘤土壤杆菌染色体DNA上的基因 同样也参与了T DNA转移作用 Ti质粒分子受到信号分子的激活作用之后 virD基因编码的一种核酸内切酶 先在T DNA的RB序列中的第3和第4碱基之间切开一个单链缺口 随后在T DNA同一条链的LB序列中切出第二个单链缺口 于是T DNA便以单链形式释放出来 并在RB序列的引导下定向地从根瘤土壤杆菌细胞转移到寄主植物细胞 当单链的T DNA转移到植物细胞之后 在有关的植物细胞酶体系的催化作用下 便会合成出互补链形成双链形式的T DNA分子 在一系列酶的参与下整合进植物基因组 这种整合是一种非正常重组 DNA非正常重组有几个特点 1 T DNA瞄准整合的位点没有序列特异性 即植物染色体上没有特定的序列结构供T DNA进行整合识别 从理论上说 T DNA整合可以在植物染色体上的任何部位发生 2 整合部位的植物DNA有一小段与T DNA端点附近区域同源的序列 这种序列一般只需几个碱基的长度 3 在重组后的重组结合部可能找到一些额外的核苷酸序列 它们被称作填充DNA filler DNA 4 重组结合部的靶DNA 受体细胞DNA 有少量缺失或存在更大部位的重组 3 植物基因转化载体系统作为植物基因的转化载体 必须具有能把外源DNA转入植物并能在其中稳定表达的性能 如果载体是病原物来源的 还必须能够不导致植物产生病症和不影响植物的品质 主要介绍以Ti质粒为基础的遗传转化系统野生型的Ti质粒Onc卸甲载体 为了使野生型Ti质粒成为基因转化的载体 必须切除T DNA上的Onc基因 即 解除 其 武装 构建成所谓 卸甲 或称 缴械 载体 disarmedvector 在这种Onc 载体中 已经缺失的T DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322区段所取代 这样任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段 都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组 而被共整合到Onc Ti质粒载体上 共整合载体系统共整合载体系统包括在T DNA上的激素合成区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分 通过三亲交配法使克隆在中间载体上的外源基因从大肠杆菌进入农杆菌中 中间载体与改造的Ti质粒之间通过同源重组使外源基因整合到T DNA区 当T DNA左右边界序列之间的激素合成基因完全缺失 就能在实验室中再生转基因植株 而不是产生转基因肿瘤组织 一元载体系统 双元载体系统Binaryvector双元穿梭载体通常小于共整合载体 能够在大肠杆菌和农杆菌中同时存在 即指由两个分别含T DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统 双元载体系统涉及到两个Ti质粒的改造 大Ti质粒的改造 主要是去除T DNA上的Onc基因 卸甲过程 甚至完全消除T DNA 保留Ti质粒上的其它部分 并保留在受体菌体中 小质粒只带有T DNA 复制起点和选择标记基因 有些仍保留VirG序列 并在T DNA上引入多克隆位点 目的基因 双元载体是指由两个彼此相容的Ti质粒构成的双质粒系统 其中一个含有T DNA转移所必需的vir区的质粒称为辅助质粒 它缺失或者部分缺失T DNA区段 另一个则含有T DNA区段 既有大肠杆菌复制启始位点 也含有农杆菌复制启始位点 目的基因 T DNA区 左边界 右边界 OriA 植物选择标记基因 细菌选择标记基因 OriE 目的基因 农杆菌工程菌的制备过程 将载有外源基因的小质粒引入含卸甲的大Ti质粒的菌株 组成含两个质粒的转化菌株 用于转化的标准质粒图谱 4 发根农杆菌的Ri质粒发根农杆菌和根癌农杆菌同属于根瘤菌科 均为革兰氏阴性菌 它们都可以侵染植物细胞 但引起不同的病症 根癌农杆菌感染植物细胞后诱导冠瘿瘤及合成冠瘿碱 故称为瘤诱导Ti质粒 发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根 这种不定根生长迅速 不断分枝成毛状 故称之为毛状根 也称为发状根 分别简称为毛根或发根 Ri质粒为根诱导质粒 Ri质粒的结构与Ti质粒的结构十分相似 可以分为T区 vir区 ori区和其它区域等几个部分 T区与Ti质粒的T DNA十分的相似 包括以下的几个部分 T区的左右边界序列 在Ri质粒的左右边界上含有25bp的重复序列 与T DNA的左右边界序列具有很高的同源性 TL DNA区 该区中含有与毛状根形成有关的rolA B C D基因群 RolA与肿瘤和毛状根的形成有关 该基因不活化时通常形成较多的不定根 而在活化的情况下与毛状根形成有关 rolB基因是Ri质粒转化过程中最关键的基因 没有该基因的参与转化细胞不可能形成毛状根组织 rolC D不活化时不会产生性状 TR DNA区 该区中含有与农杆碱合成有关的基因 ags 和生长素合成有关的基因 tms1 tms2 Ags基因在转化的初期起着重要的作用 是不定根产生的关键 植物遗传转化技术和方法 一 概念随着世界人口的不断增长 要求农作物生产要大幅度提高产量 但继续靠传统的方法似乎困难很大 一个可能的解决办法是发挥非传统方法的优势 分子生物学可以弥补传统农业方法的不足 分子生物学是生物技术的基础 分子生物技术大致包括如下几个内容 可以大概定义为基因的鉴定与分离 基因的克隆 新基因的合成及新的基因结构向细胞中转移 植物遗传转化 又称转基因 或植物基因工程 其研究的关键是利用重组DNA 细胞组织培养或种质系统转化等技术 将外源基因导入植物细胞或组织 使之定向重组遗传物质 改良植物性状 培育优质高产作物新品种 自1983年首例转基因植株诞生 天然植物基因工程开始在人工控制下定向改良植物的遗传性状 与常规育种方法相比 它具有以下一些特点 不受亲缘关系的限制 可实现动物 植物和微生物间遗传物质的交流 从而充分利用自然界存在的各种遗传资源 有效地打破有利基因和不利基因的连锁 充分利用有用基因 加快育种进程 缩短育种年限 二 历史种子和幼苗对DNA的吸收上世纪六 七十年代 人们就仿效细菌转化方法开展了植物转基因的尝试 1974年 Ledoux用细菌的DNA浸泡维生素B1缺陷型的拟南芥种子 结果观察到有少数浸泡的后代植株能在缺乏维生素B1的培养基上生长 这是较早的可信的种子转化法 Hess等用来源于红花矮牵牛的总DNA浸泡白色矮牵牛的种子 观察到少数后代植株开红花 2 DNA的花粉吸收1976年Hess等进一步用人工培养萌发的花粉与外源总DNA溶液混合授粉 结果在后代植株中发现了外源基因表达的性状 并检测到外源基因表达的酶活性 这为后来的花粉管通道法提供了理论基础 3 细胞对DNA的吸收 三 转基因植物的应用现状植物转基因技术在改善生物的抗性 提高生物品质 创造新种质或品种 人类保健和医药等方面具有较大应用优势 1种植面积转基因作物主要分布在美洲的美国 阿根廷 加拿大 墨西哥 此外 在亚洲的中国 欧洲的西班牙和法国 非洲的南非和大洋洲的澳大利亚也均有种植 转基因作物投入商业化生产以后 发展非常迅速 种植面积每年以成倍的速度增加 1996年全球种植面积为1 7百万公顷 到2001年为52 6百万公顷 在6年之内增长近30倍 2 四种主要转基因作物种植情况2001年 种植面积最大的4种转基因作物为 大豆 3330万公顷 占同类作物面积的46 较2000年增加了10 棉花 680万公顷 占同类作物面积的20 油菜 270万公顷 占同类作物面积的11 玉米 980万公顷 占同类作物面积的7 3 种植分布到2001年 已有13个国家的550万农户种植了转基因作物 4个主要种植国为 美国 3570万公顷 占68 阿根廷 1180万公顷 占22 加拿大 320万公顷 占6 中国 160万公顷 占3 其次发展较快的国家是澳大利亚和南非 分别比2000年增加了37 33 其他适度发展的国家有墨西哥 保加利亚 乌拉圭 罗马尼亚 西班牙 印尼和德国 4 转基因作物产品的销售情况1995年 全球转基因作物的销售额为0 84亿美元 1996到1998年依次为3 47 11 13 22 59 至1999年增到29 31亿美元 销售额5年内增加了36倍 据ISAAA预测 2005年达到60亿美元 2010年达到200亿美元 5 转基因改良的作物性状目前 转基因作物性状主要集中表现为抗除草剂 抗虫等 2001年共种植转基因抗除草剂作物4060万公顷 占77 转基因抗虫作物780万公顷 占15 同时抗除草剂和抗虫作物420万公顷 占8 这些常被称为第一代转基因作物 即基因性状为减少投入的性状 第二代转基因性状是指增加产出性状 包括品质改良 加工增值 专用产品 医药保健等 四 遗传转化方法和技术根癌农杆菌介导的植物转基因根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法是目前研究最多 机理最清楚 技术方法最成熟的转基因方法 第一批能表达外源基因的转基因植物就是用根癌农杆菌介导法获得的 迄今所获得的200多种转基因植物中 80 以上是利用根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法产生的 野生农杆菌的致瘤作用 图10 1农杆菌侵染伤口的模式图 常用的农杆菌菌株及特性一般来说 染色体背景为C58的菌株生长速度快 不结球 在转化实验中易于操作 染色体背景为Ach5的菌株生长慢 菌株培养过程中结球 在转化实验中难于操作 其培养后不易洗掉 转化过程 图10 2农杆菌侵染植物的过程 T DNA在植物染色体中的插入是随机的 它可插入任何一条植物染色体 但插入位点常有以下特点 优先整合到转录活跃的植物基因位点 T DNA与植物DNA连接处富含A T碱基对 植物DNA上的插入位点与T DNA边界序列有一定程度的同源性 影响农杆菌T DNA转移的因素 影响农杆菌介导的遗传转化效率的因素 1 农杆菌菌株不同的农杆菌菌株有不同的宿主范围 并有其特异侵染的最适宿主 不同类型的农杆菌菌株的毒力 侵染力 不同 一般而言 三类农杆菌菌株的侵染力的排列顺序为 农杆碱型 琥珀碱型 菌株 如A281 胭脂碱型菌株 C58 章鱼碱型菌株 Ach5 LBA4404 2 农杆菌菌株的生长时期高侵染活力的菌株一般处在对数生长期 也即0 3 1 8OD600范围 1 0OD 1x109cell ml 一般用0 3 1 0OD600农杆菌菌液接种植物材料 EffectofAgrobacteriumconcentrationonfrequencyofresistant callus AgrobacteriumNo callusFreq ofresistantconc OD600 testedcallus 0 521014 2 1 9a1 019411 0 0 46b1 51805 6 0 6c 3 基因活化的诱导物Vir区基因的活化是农杆菌Ti质粒转移的先决条件 酚类化合物 单糖或糖酸 氨基酸 磷酸饥饿和低pH都影响Vir区基因的活化 在操作过程中 最常用的诱导物是乙酰丁香酮 AS 和羟基乙酰丁香酮 HO AS 但AS效果更佳 Effectofacetosyringone AS concentrationonfrequencyofresistant callus ASconcentration mgl 1 No callusestestedFreq ofresistantcalluses 01946 7 0 5b5020617 6 3 8a10018711 2 1 2b 4 外植体的类型和生理状态只有处于细胞分裂S期 DNA合成期 的细胞才具有被外源基因转化的能力 因此 细胞具有分裂能力是转化的基本条件 一般来说 发育早期 幼年期 的组织细胞转化能力较强 Effectofdifferentperiodsofembryogeniccallus EC aftersubcultureonfrequencyofresistant callus Daysaftersubculture d No callusestestedFreq ofresistantcalluses 81906 8 2 1b1518814 9 0 7a212037 8 O 4b 5 外植体的预培养外植体的预培养有以下作用 促进细胞分裂 使受体细胞处于更容易整合外源DNA状态 田间取材的外植体通过预培养起到驯化作用 使外植体适应于试管离体培养的条件 有利于外植体与培养基平整接触 因为外植体在开始培养过程中 由于其迅速生长而出现上翘和卷曲 使农杆菌的接种切面离开培养基致使农杆菌生长受抑制而不能实现对受体的转化 6 外植体的接种及共培养外植体的接种是指把农杆菌工程菌株接种到外植体的侵染转化部位 常用的方法是将外植体浸泡在预先准备好的工程菌株中 浸泡一定时间后 用无菌吸水纸吸干 然后置于共培养培养基进行共培养 共培养即指农杆菌与外植体共同培养的过程 掌握共培养技术和条件是转化成功的关键 农杆菌附着外植体表面后并不能立刻转化 只有在创伤部位生存8 16h之后的菌株才能诱发肿瘤 因此 共培养时间必须长于8 16h 共培养时间不宜太长 否则 可能会由于农杆菌的过度生长而使植物细胞受到毒害而死亡 一般共培养时间为2d 转化细胞的选择培养和高频再生 1 转化细胞的选择选择转化细胞是基因转化重要的步骤 DeBlock等 1995 转化细胞和非转化细胞在非选择培养基上生长存在着竞争 而且往往非转化细胞在这种条件下生长更具优势 转化难以成功 在选择培养中加入选择试剂可以抑制非转化细胞的生长 而对转化细胞的生长无抑制作用 从而起到选择效果 选择试剂的使用浓度 即选择压 应根据植物的特性来定 比较敏感的植物要用较低浓度的选择试剂 另外 一般选择试剂对植物材料有毒害 直接影响植株的再生 选择方法归纳起来有两种 一种是先再生后选择 即在植株再生过程不加选择压 待植株再生后再进行选择 这种做法最大的弊端是嵌合体严重 假转化体多 后期选择困难 第二种是先选择后再生 即在转化后愈伤组织诱导或不定芽分化培养的一开始就加入选择压 这种方法嵌合体少 假转化体少 2 高效转化体再生转化体系的转化频率高低在很大程度取决于转化体再生系统的优劣 而再生系统的主要因素是培养基 转化后的细胞再生困难 可能是由于选择剂的影响造成的 植物转化的选择标记目前广泛使用的选择标记是NPTII neomycinphosphotransferase typeIIenzyme 新霉素磷酸转移酶 能降解卡那霉素和G418 另外还有抗hygromycin的基因 bar基因 CAT 氯霉素乙酰转移酶基因 除选择标记外 还有一些报告基因 reportgene 如 GUS 葡萄糖苷酶基因 bar GFP等 抗生素对植物细胞的毒害作用 转化技术 1 整株感染一般采用种子实生苗或试管苗作为外植体 在整体植株上造成创伤 然后把农杆菌接种于创伤面上 或用针头把农杆菌注射到植物体内 使其进行侵染转化 优点 不需经过组培过程缺点 筛选困难 2 叶盘法 图10 3叶圆盘转化法 是双子叶植物较为常用的简单有效的方法 一般是选取健康的无菌苗利用打空器打出圆形的叶片 将刚打出的带有新鲜伤口的叶圆盘与农杆菌进行短期的共培养 农杆菌通过伤口使携带外源基因的T DNA进入植物细胞 使外源基因整合进植物基因组中 叶片 叶柄 茎 子叶 子叶柄 胚轴是目前应用最广的外植体 使用哪种外植体应根据不同的植物而定 叶圆盘转化法的操作程序 叶圆片或下胚轴切段过夜培养的农杆菌 25 280C 稀释菌液共培养2 3天取出植物材料 浸泡3 5分钟无菌纸戏干转到加有选择剂和cefotaximeorcarbinecillin 500mg l 的培养基上一个月后将生长者转入含上述成分的新鲜培养基上检测再生检测 3 基因枪介导法基因枪法 又称生物弹法或微粒枪法 微粒轰击法 是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术 基因枪法是继农杆菌介导法之后又一应用较广的遗传转化技术 优缺点 优点 无宿主限制 靶受体类型十分广泛 几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞 有特殊的应用 可将外源DNA转入线粒体 叶绿体 也可用于花粉转化 作图法基因克隆 启动子研究 与根癌农杆菌协同转化等 易于操作 一枪可以命中多个目标 细胞遭粒子轰炸后仍能成活 这一方法仅与一些物理参数有关缺点 转化频率低 嵌合体较多 结果的重复性差且转化的外源基因以多拷贝居多易导致基因沉默 遗传稳定性差 而且实验成本较高 转化原理这种方法是在微粒子表面衣裹DNA 然后用粒子加速器将粒子加速 高速粒子可以穿入各种组织或组织 从而完成DNA的输送 这一技术对于难以再生的植物的转基因较有用 图10 4基因枪转基因示意图 注意事项1 操作应在无菌条件下进行 植物材料应是分裂旺盛的组织2 DNA的质量要高3 转化前对植物材料进行一定的渗透处理有利于转化效率的提高4 转化前需要对转化参数进行优化5 转化后需要将材料静置培养1天或更长时间才能转移到筛选培养基上选择培养 4 电激法原理是利用高压电脉冲作用 在原生质体膜上 电激穿孔 细胞膜上会出现短暂可逆性开放小孔 为外源物质提供了通道 籍此可以导入外源DNA RNA 蛋白质 病毒颗粒等多种生物大分子以及核苷酸和染料等多种小分子 特别是在禾谷类作物中有发展潜力 5 PEG转化法PEG法最早用于水稻遗传转化并获得转基因水稻植株 原理是将水稻原生质体悬于含质粒DNA的PEG中 由于渗透压的作用 质粒DNA透过原生质体膜进入细胞内 随机地整合到水稻的基因组中 经原生质体再生成完整植株 6 花粉管通道法花粉管通道法是由周光宇等 1978 建立并在长期科学研究中发展起来的 原理是授粉后使外源DNA能沿花粉管渗入 经过珠心通道进入胚囊 转化尚不具备正常细胞壁的卵 合子或早期胚胎细胞 花粉管通道法转化实质是受精过程转化 花粉粒在柱头上萌发形成花粉管 不断向胚囊伸长 滴注在柱头上的外源DNA随着花粉管进入胚囊 虽然至今学术界对此方法尚存争议 但由于这种转基因技术不需要昂贵的仪器设备和组织培养技术 又不受克隆基因数量的限制 转化率显著高于其他转基因技术 还可以转移多基因控制的数量性状 20多年来在水稻 小麦 棉花 大豆等作物上所获得的成功实例已充分地证明了这一技术的可行性 7 超声波转化法现在超声波击穿细胞的机制还不是很清楚 但一般认为有以下两种可能性 第一 超声波引发的空化泡破裂时产生的高压与高温冲击波可能导致局部细胞质膜的破裂 在细胞质膜复原以前 就有可能吸收周围物质如DNA分子等 从而发生转化现象 第二 Zimmermann等的电场机制模型发展而来 在超声波作用下 细胞膜内的流体静压力足够高以至于引发细胞膜的机械破裂 8 浸泡法DNA浸泡法包括DNA浸种 DNA浸苗 DNA浸胚 DNA浸芽四种方法 浸泡法是一种简单 快速 方便的转化方法 现已有报道证明外源基因DNA可通过浸泡的方式进入到植物的分生组织细胞中 并在受体基因组中整合和表达 水稻种子浸泡法获得了转基因植株 先将灭菌种子用无菌水浸泡12h 然后分别转入培养皿中 皿中加浓度为l20 g mL的DNA溶液 溶解在TE中 液面刚好盖过种子 28 浸泡48h后 转到含30 g mL的G418的琼脂上进行抗性筛选 转基因植株的检测 基因转化操作后 外源基因是否进入受体植物细胞 进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上 整合到染色体上的外源基因是否表达以及能否产生理想的目的表型等 都需要进行系列的检测分析 为什么要对转基因植物进行检测 转基因植物的检测标准包括以下几个方面 被检材料的鉴定实验要设立严格的对照 包括阳性及阴性对照 提供转化当代植株的外源基因整合和表达的分子生物学证据 包括物理数据 PCR southern杂交 northern杂交 western杂交等 与表型数据 酶活性分析或其它 提供外源基因控制的表型性状证据 如抗虫 抗病等 根据该植物的繁殖方式 有性繁殖还是无性繁殖 提供稳定遗传证据 有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状传递给后代的证据 无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据 一 外源基因整合的分子检测PCR检测利用PCR扩增检测外源基因整合时 要以被检组织DNA为模板 以外源基因序列设计引物进行扩增 然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物 若被检植株基因组DNA中含有外源基因 则可得到扩增产物 琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带 非转化植株基因组DNA中不含有外源基因 则无特异性扩增条带出现 MCtransgenicplants PCR检测只能初步判断基因是否插入植物基因组 并不能100 肯定是转化体 因为PCR很容易产生假阳性 问题 为什么PCR扩增不同的转基因植株 扩增片段的分子量是一样的 注意 PCR扩增可以扩增选择标记基因 也可扩增目的基因 标记基因的存在并不能完全代表目的基因的存在 2 Southern杂交检测具体方法有Southern斑点杂交 Southern印迹杂交及Southern原位杂交 确定外源基因在染色体上的位置 三种 Southern杂交实验涉及四大内容 被检植物的DNA提取 杂交探针制备 DNA样品酶切 电泳 变性 印迹及杂交 杂交结果的检出 Southern杂交可达到的目的 检测外源基因是否插入植物基因组 比PCR可靠 外源基因插入的拷贝数 3PCR Southern杂交检测 由于Southern杂交需要DNA的量比较大 在转化的材料比较少时 从基因组中抽提DNA酶切后不能满足Southern杂交的需要 在这种情况下 需要根据目的基因设计引物 对转基因植株基因组DNA进行扩增 扩增产物转移到尼龙膜上 然后用目的基因片段作探针进行杂交检测 所以称PCR Southern杂交检测 这种方法存在一定的不可靠性 所以往往不被认同 二 外源基因表达的检测基因表达包括转录和翻译两个水平 转录是指以DNA 基因 为模板合成mRNA的过程 翻译是指以mRNA为模板合成蛋白质的过程 那么 检测外源基因的表达包括检测特异mRNA和特异蛋白质 检测特异mRNA的主要方法是RT PCR和Northern杂交 特异蛋白质表达的检测方法主要有三种 生化反应检测法 主要通过酶反应来检测 免疫学检测法 通过目的蛋白 抗原 与其抗体的特异性结合进行检测 具体方法有免疫沉淀法 酶联免疫吸咐法 ELISA 及Western杂交 生物学活性的检测 RT PCR 其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行反转录 然后再经PCR扩增 如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA扩增带 则表明外源基因实现了转录 Northern杂交检测外源基因是否转录的分子检测手段 有杂交信号 说明基因转录了 在转录水平上表达了 其过程是 提取转基因植物的RNA并转膜 用目的基因的DNA制备探针 印迹杂交 4Western杂交 在证明外源基因表达出特异的mRNA后 还需要进一步证明表达出的mRNA能翻译成特异蛋白质 若外源基因的表达产物是一种酶 则可以通过测定转化植株中该酶活性来达到检测该外源基因的表达情况之目的 若表达产物不是酶 就要采用免疫学方法检测 Western杂交具有很高的灵敏性 可以从植物细胞总蛋白中检出50ng的特异蛋白质 其原理是 转化的外源基因正常表达时 转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白 从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离 将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上 同抗体进行杂交 根据检出结果 可得知被检植物细胞内目的蛋白表达与否 表达量的高低 及大致的分子量 GUS基因检测Gus基因是一种报告基因 报告基因系指其编码产物能够被快速测定的一类基因 常用来检测转基因的瞬间表达 Gus基因来源于细菌 其功能是编码 葡萄糖苷酸酶 glucuronidase GUS 该酶能催化许多 葡萄糖苷酯类物质的水解 绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性 因而Gus基因被广泛用作转基因植物的报告基因 用于GUS检测的常用底物有三种 5 溴 4 氯 3 吲哚 D葡萄糖苷酸酯 X Gluc 4 甲基伞形酮酰 D 葡萄糖醛酸苷酯 4 MUG 及对硝基苯 D 葡萄糖醛酸苷 PNPG HistochemicallocalizationofGUSactivity LocalizationofGUSactivitywasdeterminedbystainingmaterialsforupto60minutesat37 inthestainingliquid 100mlstainingliquidincludes90mgX gluc 10mgchloromycetin 20 V V methanol 1 V V Triton 100 50mlbufferofNaH2PO4 pH7 0 accordingtoJeffersonetal 22 Stainedtissueswereclearedofchlorophyllwith70 ethanolforthreetimes Photographsweretakenundermicroscope OlympusSZH10 Gus基因的定性测定 组织化学染色法Gus基因的定量测定 分光光度法 转基因植物 抗逆 耐盐 抗冻 耐干旱等 转基因植物我国科学家在耐盐 抗冻 耐旱等基因工程上取得了一些进展 包括转基因耐盐苜蓿 耐旱草坪草和水稻 我们希望将来能够用海水浇灌植物 让广袤和干旱的西部地区变成绿洲和良田 耐盐烟草的培育 Na H 逆向转运蛋白 Na H antiporterprotein 是一类跨膜蛋白质 在农业领域具有应用前景 近年来 越来越多的分子生物学 生物化学 细胞学 生理学及进化学上的证据表明 大多数Na H 逆向转运蛋白在植物生长发育的各个阶段和不同的部位 以不同的方式保护植物免受高浓度Na 的侵害 因此Na H 逆向转运蛋白基因在耐盐基因工程方面具有较高的应用价值 耐盐基因的克隆 BrassicanapusNa H antiporter 用于烟草遗传转化的植物载体 pBIBnNHX1 BnNHX1 BrassicanapusNa H antiportergene Primerpositions indicatedbyarrows PCRproductsizeandrestrictionenzyme XbaI siteusedforSouthernanalysisarealsoshown 再生植株 共培养 检测目的基因的整合 转录和翻译 农杆菌 筛选培养 外殖体 转基因植株 田间抗性测定 遗传分析等 烟草种子 发芽 分化芽 愈伤组织 继代 去外殖体生根培养 人工小气候培养 转基因烟草植株中BnNHX1基因的Southernblot分析 Lanes2 8 independenttransgenicplantscorrespondingtoplantnos 3 5 6 10 11 15and23 Lane9 pBIBnNHX1 positivecontrol Lanes1 6 independenttransgenicplantscorrespondingtoplantnos 5 10 6 15 23and11respectively Lane7 anuntransformedplant 转基因烟草植株中BnNHX1基因的Nouthernblot分析 转基因烟草当代 T0 对盐的耐受性分析 a 左 非转基因的烟草在没有NaCl处理的情况下 右非转基因的烟草在在200mMNaCl生长3天 b 左 转基因的烟草T0plant no 11 在没有NaCl处理的情况下 右 转基因的烟草T0plant no 11 在200mMNaCl处理下生长10天 c 左 转基因的烟草T0plant no 11 在200mMNaCl正常生长 开花结实 右 非转基因的烟草在没有NaCl处理的情况下开花结实 d 左 转基因的烟草T1plant no 11 PCR检测含有甘蓝型油菜Brassicanapus的Na H 逆向转运蛋白基因 在200mMNaCl处理下生长 右 转基因的烟草T1plant no 11 PCR检测不含有甘蓝型油菜Brassicanapus的Na H 逆向转运蛋白基因 在200mMNaCl处理下生长 耐盐基因的克隆 SOS2 耐盐基因的克隆 SOS2 抗冻基因的克隆 CBF 抗冻基因的克隆 CBF 抗冻基因的克隆 ICE 抗冻基因的克隆 ICE 抗冻基因的克隆 ICE 耐干旱基因的克隆 GbTPS Inmanyorganisms trehaloseactsasprotectivemetaboliteagainstharshenvironmentalstresses suchasfreezing drought nutrientstarvation heatandsalt GbTPSwasfoundtobeinducedbyavarietyofstressesincludingcold salt droughtandmannitol 转基因植物 抗病虫害转基因植物我国的科学家已成功地改造了来自天蚕蛾的抗菌肽基因 转入到马铃薯 获得了抗病性提高的抗病转基因马铃薯 目前利用相同的技术进行抗水稻白叶枯病 马铃薯软腐病 花生和番茄的青枯病等抗细菌病基因工程研究 我国的科学家还开展了抗病毒基因工程研究 研制成功了抗黄瓜花叶病毒甜椒和番茄 转基因棉花 对照 Transgenicriceforinsectanddiseaseresistance RecentstudiesshowedthatsomeplantlectinsweretoxictoBPHinanartificialdietassay Powelletal 1993 1995 amongwhichthelectin GNA fromsnowdrop Galanthusnivalis isthemosttoxic GNA stoxicitytoBPHandnon toxicitytomammals Pusztaietal 1990 makesitapotentialcandidatetobeusedingeneticengineeringofriceforthecontrolofBPH SnowdropplantGalanthusnivalis GUS 1 GUS 2 HPT 1 HPT 2 GNA 1 GNA 2 pWGR1515 pRSSGNA1 1540bp 1270bp 477bp KpnI SacI RSS1 gna PN1234567891011 12kb 9kb 6kb 4kb 3kb PN12345678910111213 GNA GeneticanalysisofR1progenyoftransgenicricelines LinegusA hpt gna No ofplantsSegregation 2Panalyzedratio W1262626353 1hpt0 0100 9223 1gusA0 0100 9223 1gna0 0100 922W2363636473 1hpt0 0640 8013 1gusA0 0640 8013 1gna0 0640 801W311111141 hpt gusA gna W4303030423 1hpt0 2860 5933 1gusA0 2860 5933 1gna0 2860 593 PlantswereanalyzedbyPCRforthepresenceofhpt gusAandgnagenes aberrantratios GeneticanalysisofR1progenyoftransgenicricelines LinegusA hpt gna No ofplantsSegregation 2Panalyzedratio Y7313131463 1hpt1 4200 2333 1gusA1 4200 2333 1gna1 4200 233Y8343434433 1hpt0 3800 5383 1gusA0 3800 5383 1gna0 3800 538Y9404040473 1hpt2 5600 1103 1gusA2 5600 1103 1gna2 5600 110Y10232323353 1hpt1 6100 2053 1gusA1 6100 2053 1gna1 6100 205Y1588845 hpt gusA gna Y16262626383 1hpt0 8770 3493 1gusA0 8770 3493 1gna0 8770 349 PlantswereanalyzedbyPCRforthepresenceofhpt gusAandgnagenes aberrantratios MPN12345678910111213 MPN12345678910111213 MPN12345678910111213 477bp 1 27kb 1 46kb a c b PCNC12345678 GNA AsGNAhasshownenhancedresistancetoBPHandGLH WewanttotestwhetherGNAcouldconferresistancetoanotherimportantricesap suckingpest thesmallbrownplanthopper Laodelphaxstriatellus SBPH anotherimportantriceHomopterapestcausingdirectdamagetoriceplantitself andalsoactingasthevectorforsomericevirusessuchasricestripevirus Gray1996 TransgenicricehomozygousR4linesofEyi105uniformlyandstablyexpressingGNAofover0 3 wereusedinthisstudies InsectbioassayresultsrevealedthatbothtestedGNA expressinghomozygouslineshadsignificantinhibitiontoSBPHbydecreasingSBPHsurvival overallfecundityandretardingitsdevelopment Bythisstudy wehavedemonstratedthattransgenicriceexpressingGNAcouldconferenhancedresistancetoSBPH anotherimportantricesap suckinginsect bydecreasingSBPHsurvivalandfecundity andretardingitsdevelopment Thisresult combinedwithearlierresults Raoetal 1998 Foissacetal 2000 Tangetal 2001 indicatesthattransgenicriceexpressingGNAispotentiallyusefulinriceinsectresistancebreeding