DNA提取和检测.doc

DNA提取和检测实验准备工作：1 所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。2 试剂配制：1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取Tris-Base 121g, 加入约800 ml 水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 灭菌后于室温保存。0.5 M EDTA (pH 8.0): 称取EDTA-Na2盐 187 g 加入约 800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可, 灭菌后于室温保存。5.0 M NaCl: 称取NaCl 300 g, 加入蒸馏水约800 ml 于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止23分钟，倒出上清液，再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml., 灭菌后于室温保存。酚：氯仿：异戍醇（25：24：1）的配制：可参考分子克隆亦可按如下方法配制取重蒸酚100 ml ，蒸馏水50 ml，8-羟基喹咛0.05g 加入500 ml玻璃烧杯于磁力搅拌器上边加热边搅拌，待酚达到水饱和后加入18 g Tris-Base，等Tris-Base 完全溶解后加入100 ml氯仿：异戌醇（24：1），搅拌1020分钟，静止约10分钟，除去上层水相后，装入棕色瓶，最后加入20 ml 0.1M的Tris-HCl保护液于4保存。DNA Buffer的配制：1 M Tris-HCl (pH 8.0) 100 ml0.5 M EDTA (pH 8.0):100 ml5.0 M NaCl:300 mlH2O500 ml灭菌后于室温下保存3个月左右，用时按1.5%往Buffer中加入CTAB，在电炉上烧开；在通风橱里加入1%的巯基乙醇( 现配现用)。DNA的提取：1 取25 g叶片或愈伤组织，加入适量液氮研碎，转入预冷的50ml离心管，加入20 ml DNA提取缓冲液充分摇匀，于65水浴6090 min，中途轻轻摇匀两次。2 加入15 ml 氯仿：异戍醇（24：1）轻轻摇匀10分钟，于BECKMAN离心机中4000 rpm离心15分钟。3 取上清液于另一50 ml离心管加入10 ml 氯仿：异戍醇（24：1）重复步骤2。4 吸上清液于一干净的50 ml 离心管，加入15 ml 冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入5 ml 76%的乙醇（含10 mM NH4Ac）浸泡5 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。5 弃乙醇风干沉淀约半小时，加入3.0 ml TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA , pH 8.0），20 l RNase A（10 mg/ml），37温浴过夜。6 溶液转入一10 ml离心管，加入3.0 ml苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）充分颠倒混匀，4000 rpm离心15 min，吸上清液于另一10 ml的离心管中，（可重复一次）。7 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水饱和乙醚，充分混匀，4000 rpm离心5 min。8 弃乙醚，用20 l枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，让下清液从缝中流入另一10 ml离心管。9 加入5 ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入3 ml 70%的乙醇浸泡46 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。风干乙醇，加入500 l TE溶解，或浸在乙醇中长期保存。DNA检测1 取DNA原液15 l稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、 260 nm及280 nm的吸光值。高质量的DNA要求：A260/A2302.0； 1.7A260/A2801.92 将DNA原液适当稀释后，用1 TAE，0.8%琼脂糖凝胶2V/cm电泳1 h进行质量检测。3 向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5U/g DNA，37消化过夜，用0.5 TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。CTAB法微量提取DNA1. 药品的配制: CTAB提取液：(1)100mM Tris-HCl(PH 8.0),1.5M NaCl,50mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP,2% CTAB(3)取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量,65水浴充分溶解备用。使用前要在65温浴一会儿，然后加入1-4%巯基乙醇,混均匀。苯酚：氯仿：异戊醇（25241）： 重蒸酚65水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水，加入少许8-羟基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶中，4冰箱中储存备用。2. 材料的采取与保存： 在超净工作台上，取试管苗叶片，放入无菌的1.5 ml离心管中，置于冰盒中，然后把装有叶片的离心管一起装在纱布袋中，置液氮中冷冻10分钟，取出后置于70冰箱中可长期保存，需要用时，取出置于冰盒中。3DNA的粗提在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用事先灭过菌的20冰箱中预冷的尖头玻棒将材料戳到底部，先压后研磨，研细后加入600 ul CTAB提取液，再继续研磨一会儿使其悬浮均匀，然后在65水浴锅中温浴60-90分钟，隔30分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之后，加入700ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下晃动10分钟以上，其间置于37水浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后10000-12000rpm离心5-10分钟，吸取上清液转至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20冰冻无水乙醇1ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA，然后8000-10000rpm离心5分钟，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。4. DNA的纯化： 向风干后的DNA中加入500 ul 1xTE，37水浴15-30分钟至DNA完全溶解，然后加入700ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，其间置于37水浴锅中温浴一会（冬季）；10000-12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入700ul氯仿：异戊醇（24：1），颠倒10分钟（方法同上），10000 -12000rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入1ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后在-20冰箱中置30分钟沉淀DNA，8000-10000 rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡,2小时后换一次,后浸泡过夜，8000rpm离心3分钟后弃酒精，风干，加50-100ul1xTE充分溶解，然后每管加5ul 5mg/ml Rnase,37水浴6小时或过夜。5. DNA检测:（1）0.8%琼脂糖凝胶电泳30-60分