苦参的化学成分指纹图谱.doc

表 3 20 批样品共有峰相对保留时间样品共有峰号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151 0. 36 0. 43 1. 00 1. 34 1. 52 1. 63 1. 76 2. 18 2. 28 2. 36 3. 07 4. 90 5. 07 5. 49 5. 672 0. 35 0. 48 1. 00 1. 31 1. 48 1. 60 1. 68 2. 13 2. 22 2. 29 2. 99 4. 79 4. 96 5. 37 5. 453 0. 35 0. 43 1. 00 1. 37 1. 57 1. 63 1. 74 2. 28 2. 37 2. 45 3. 15 4. 94 5. 11 5. 52 5. 604 0. 35 0. 43 1. 00 1. 33 1. 54 1. 61 1. 73 2. 29 2. 38 2. 46 3. 16 4. 94 5. 11 5. 53 5. 615 0. 35 0. 43 1. 00 1. 33 1. 51 1. 62 1. 71 2. 17 2. 26 2. 34 3. 05 4. 87 5. 04 5. 46 5. 556 0. 35 0. 43 1. 00 1. 33 1. 54 1. 68 1. 77 2. 27 2. 36 2. 45 3. 17 4. 99 5. 17 5. 62 5. 677 0. 34 0. 41 1. 00 1. 28 1. 54 1. 62 1. 70 2. 18 2. 27 2. 35 3. 04 4. 79 4. 95 5. 36 5. 458 0. 35 0. 42 1. 00 1. 32 1. 53 1. 65 1. 75 2. 24 2. 33 2. 41 3. 11 4. 90 5. 07 5. 48 5. 579 0. 35 0. 44 1. 00 1. 33 1. 51 1. 57 1. 68 2. 19 2. 28 2. 36 3. 04 4. 79 4. 96 5. 36 5. 4510 0. 33 0. 40 1. 00 1. 26 1. 42 1. 54 1. 62 2. 05 2. 14 2. 21 2. 88 4. 59 4. 75 5. 14 5. 2211 0. 36 0. 42 1. 00 1. 33 1. 51 1. 64 1. 71 2. 17 2. 26 2. 34 3. 05 4. 87 5. 04 5. 45 5. 5312 0. 36 0. 44 1. 00 1. 33 1. 50 1. 62 1. 70 2. 16 2. 25 2. 33 3. 04 4. 87 5. 04 5. 46 5. 5413 0. 36 0. 43 1. 00 1. 33 1. 51 1. 63 1. 71 2. 17 2. 26 2. 34 3. 05 4. 86 5. 03 5. 44 5. 5214 0. 34 0. 40 1. 00 1. 26 1. 42 1. 54 1. 62 2. 05 2. 14 2. 21 2. 88 4. 58 4. 74 5. 13 5. 2015 0. 36 0. 42 1. 00 1. 33 1. 51 1. 62 1. 72 2. 18 2. 27 2. 35 3. 05 4. 86 5. 03 5. 44 5. 5216 0. 33 0. 40 1. 00 1. 26 1. 42 1. 54 1. 62 2. 05 2. 14 2. 22 2. 88 4. 58 4. 74 5. 13 5. 2017 0. 33 0. 40 1. 00 1. 26 1. 42 1. 54 1. 62 2. 05 2. 14 2. 21 2. 88 4. 58 4. 74 5. 12 5. 2018 0. 33 0. 40 1. 00 1. 26 1. 42 1. 54 1. 61 2. 05 2. 13 2. 21 2. 87 4. 60 4. 76 5. 15 5. 2319 0. 33 0. 40 1. 00 1. 26 1. 42 1. 54 1. 61 2. 05 2. 13 2. 21 2. 88 4. 59 4. 76 5. 14 5. 2220 0. 35 0. 42 1. 00 1. 33 1. 51 1. 63 1. 71 2. 17 2. 26 2. 34 3. 05 4. 86 5. 03 5. 44 5. 53平均值 0.35 0. 42 1.00 1.31 1. 49 1. 60 1.69 2.15 2. 24 2. 32 3. 01 4. 79 4.95 5. 36 5.45RSD% 3. 29 4. 70 0. 00 2. 72 3. 39 2. 81 3. 17 3. 77 3. 69 3. 69 3. 37 3. 00 2. 99 3. 04 3. 10表 4 20 批样品共有峰峰面积比值样品共有峰号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151 16. 67 0. 95 1. 00 0. 21 0. 27 0. 85 0. 68 0. 49 2. 01 2. 40 1. 20 3. 01 5. 68 0. 25 0. 452 29. 32 0. 30 1. 00 2. 46 0. 81 2. 57 1. 13 4. 02 14. 96 4. 26 4. 81 13. 11 50. 38 2. 25 13. 653 39. 16 2. 03 1. 00 2. 61 21. 58 3. 89 8. 02 8. 51 31. 70 6. 51 6. 18 11. 98 35. 89 1. 15 13. 384 148. 96 5. 82 1. 00 6. 51 32. 68 13. 03 21. 99 19. 44 84. 37 25. 66 14. 13 44. 67 171. 63 7. 66 43. 225 20. 26 0. 71 1. 00 0. 66 0. 76 1. 88 0. 71 1. 50 6. 77 2. 31 1. 62 8. 24 15. 95 0. 94 4. 206 34. 76 2. 90 1. 00 2. 31 0. 79 0. 07 1. 52 4. 11 15. 71 5. 07 4. 50 18. 79 60. 77 0. 28 15. 687 95. 56 5. 49 1. 00 3. 96 0. 61 0. 68 3. 61 6. 02 30. 72 9. 66 10. 39 60. 33 103. 57 1. 99 32. 728 120. 13 5. 56 1. 00 5. 66 7. 43 16. 34 3. 59 13. 06 47. 32 15. 32 15. 34 53. 00 138. 94 2. 40 37. 459 68. 67 1. 44 1. 00 1. 68 12. 13 3. 85 10. 16 5. 78 24. 09 7. 38 6. 11 89. 86 281. 30 5. 81 31. 3310 142. 27 3. 77 1. 00 7. 50 11. 36 15. 11 5. 04 15. 45 45. 17 13. 07 9. 97 95. 91 273. 04 12. 14 19. 6011 113. 96 2. 83 1. 00 5. 03 3. 96 9. 00 5. 89 6. 53 25. 51 7. 94 9. 57 65. 16 187. 84 5. 84 12. 5012 66. 63 1. 60 1. 00 2. 99 2. 63 6. 10 3. 88 2. 94 13. 83 4. 06 4. 10 28. 50 86. 25 3. 21 6. 8713 90. 51 1. 84 1. 00 3. 13 2. 98 4. 40 2. 19 2. 82 12. 72 4. 55 4. 82 27. 72 119. 32 4. 56 5. 8814 125. 89 3. 17 1. 00 5. 82 6. 18 13. 13 3. 76 11. 36 33. 30 10. 04 6. 58 72. 68 139. 80 3. 94 1. 4915 35. 80 0. 55 1. 00 1. 08 1. 27 3. 09 0. 73 2. 66 7. 51 2. 40 1. 85 13. 73 59. 62 3. 10 12. 6816 188. 65 4. 54 1. 00 7. 86 8. 98 20. 20 4. 06 19. 46 69. 25 18. 79 12. 77 121. 15 233. 23 6. 80 17. 6017 142. 78 6. 21 1. 00 4. 92 4. 55 8. 33 2. 88 6. 60 32. 34 9. 65 12. 86 41. 95 207. 42 6. 27 11. 9718 118. 92 3. 11 1. 00 4. 63 2. 46 12. 59 3. 58 9. 57 44. 99 12. 77 9. 80 42. 05 106. 10 2. 81 4. 2719 177. 14 6. 16 1. 00 6. 09 3. 81 14. 99 5. 10 12. 87 66. 13 17. 89 12. 01 67. 04 166. 55 6. 50 25. 1620 97. 40 3. 08 1. 00 4. 65 2. 69 9. 50 2. 68 7. 27 35. 22 9. 66 8. 14 41. 69 61. 68 2. 47 8. 653. 7 指纹图谱相似度评价对 1 个苦参对照药材、19 个不同产地野生和人工栽培的苦参样品的 HPLC 指纹图谱共有峰进行相似度计算，以相关系数表征相似度，结果见表 5，从中可以看出，19 个苦参样品指纹图谱共有峰与对照药材(1 号样)相似度为 0. 96 0. 99，其中甘肃成县产野生苦参(7 号样)和河北承德产野生苦参(8 号样)与对照药材的相似度最高，而栽培苦参与对照药材的相似度相对较低。19 个苦参样品之间相似度为 0. 93 0. 99，岷县栽培 1 年生苦参(2 号样) 与其他各样品之间相似度最低，可能是栽培年限低的原因。结果表明，栽培苦参和野生苦参存在差异，但是 20 个样品指纹图谱的相似度大于0. 93，说明建立的苦参样品指纹图谱相似度较高，具有一定5372010 年 4 月第 32 卷 第 4 期中 成 药Chinese Traditional Patent MedicineApril 2010Vol. 32 No. 4220 nm，235 nm，245 nm 和 255 nm 5 个检测波长下的色谱峰，选择波长 235 nm 为检测波长。表 2 苦参药材梯度洗脱程序时间/min A/% B/%053040556010204060951009080604050在上述优化色谱条件下，色谱峰的分离度好，色谱峰在 0 60 min 内分布，氧化苦参碱对照品和苦参对照药材色谱图见图1 和图2。图2 与图1 比较可知，在相同色谱条件下，氧化苦参碱的保留时间与苦参对照药材色谱图中的 3 号峰一致。因此，推测对照药材色谱图中的3 号峰为氧化苦参碱。图 1 氧化苦参碱对照品 HPLC 色谱图图 2 对照药材 HPLC 指纹色谱图3. 2 提取条件的优化选择以苦参药材为样品，选择不同提取方法，不同溶剂进行比较试验。回流提取用 50% 甲醇和 85% 乙醇作溶剂，回流时间 1 h，超声提取用 50% 甲醇、85% 乙醇、氯仿作溶剂，用以上 5 种方法制备的供试品溶液，分别在上述优化色谱条件下进样，记录色谱图，根据色谱图综合评价提取效果，结果发现50%甲醇回流1 h 的色谱图出峰多，因此采用50%甲醇回流 1 h 提取方法为本实验的最佳提取方法。3. 3 精密度取一份苦参样品(5 号样)的供试溶液，在上述色谱条件下，重复进样 5 次，记录指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间 RSD 为 0. 3% 2. 08%，峰面积比值的 RSD 为 1. 05% 3. 69% ，符合指纹图谱的检测要求。3. 4 稳定性取一份苦参样品(5 号样)的供试溶液，在上述色谱条件下，分别在 0，2，4，8，24 h 进样测定，记录指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间 RSD 为 0. 3% 2. 87%，峰面积比值的 RSD 为1. 15% 4. 66%，表明供试液在15 h 内基本稳定。3. 5 重复性取苦参样品(5 号样)5 份，分别精密称定，按供试品溶液制备方法平行制备供试液，在上述色谱条件下，分别进样记录指纹图谱。计算各共有峰的相对保留时间 RSD 为0. 09% 3. 32%，峰面积比值的 RSD 为 0. 44% 4. 58%，符合指纹图谱的检测要求。3. 6 指纹图谱建立与分析按上述液相色谱条件测定了氧化苦参碱对照品、1 个苦参对照药材、19 个不同产地野生和人工栽培的苦参样品。采用相对保留时间确认指纹峰。色谱图中以氧化苦参碱作为参比峰，相对保留时间即各指纹峰保留时间与同一图谱中氧化苦参碱峰保留时间的比值。指纹峰峰相对峰面积即各指纹峰面积与同一图谱中氧化苦参碱峰面积的比值。结果显示，人工栽培苦参图谱峰的数量普遍较对照药材和野生药材图谱少，有些峰缺失。根据各样品图谱中色谱峰的相对保留时间，以氧化苦参碱对照品和对照药材指纹图谱作为参照谱，选择了其中 15 个色谱峰作为指纹图谱的特征峰(图 2，3，4)，3 号峰为氧化苦参碱，各共有峰相对保留时间 RSD 小于 5%(表 3)。计算共有峰的相对峰面积，建立苦参的指纹图谱(表 4)。对 15 个共有峰相对保留时间进行聚类分析，结果见图5，15 个共有峰可分为5 个峰群，1 号峰和2 号峰归为第 1 个峰群，3，4，5，6，7 号峰归为第 2 个峰群，8，9，10 号峰归为第 3 个峰群，11 号峰为第 4 个峰群，12，13，14，15 号峰归为第 5 个峰群。图 3 野生药材 HPLC 指纹色谱图图 4 栽培药材 HPLC 指纹色谱图5362010 年 4 月第 32 卷 第 4 期中 成 药Chinese Traditional Patent MedicineApril 2010Vol. 32 No. 4苦参的化学成分指纹图谱纪 瑛(甘肃农业职业技术学院，甘肃 兰州 730020)收稿日期:2009-06-16基金项目:甘肃省科技攻关项目(2GS064-A43-019-08)资助作者简介:纪 瑛(1963 )，女，副教授，博士，研究方向:中药材栽培与质量。TelEmail:lzjiying2005163. com关键词:苦参; 人工栽培; 指纹图谱; 相似度计算摘要:目的:建立苦参化学成分指纹图谱，比较苦参人工栽培药材与野生药材之间的化学成分差异，为苦参的质量控制提供参考。方法:采用高效液相色谱法测定了 3 个不同产地的苦参野生药材样品和 16 个不同产地人工栽培药材样品的的指纹图谱，色谱柱 C18(150 mm 6. 4 mm)，以水-乙腈为流动相，流速 0. 5 mL /min，检测波长为 235 nm。该方法的精密度、稳定性和重复性均好。结果:建立了苦参样品的化学成分指纹图谱，以氧化苦参碱为参照，鉴定 15 个共有峰，分成 5个峰群，经相似度计算，19 个苦参样品之间相似度为 0. 93 0. 99。结论:人工栽培药材与野生药材之间存在一定差异，表现栽培年限越低相似度越低。中图分类号:R284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-1528(2010)04-0535-04苦参(Sophora flavescens Ait)为豆科槐属植物，是我国传统药用植物1。分布于河北，河南，陕西，甘肃，辽宁一带的浅山区与坡地。苦参有清热利湿，祛风杀虫之功效，现广泛应用于治疗急性细菌性痢疾，顽固性湿疹等疾病2，近年又用于治疗非典和肿瘤3，尤其是天然绿色动植物杀虫剂的开发使用4，5，使其用途越来越广，随着其用途的不断研究与开发，其用量呈逐年递增之势。长期以来一直是以采挖野生资源提供药源。由于过度采挖，使野生资源日渐耗竭，难以维持快速发展工业生产的药源。现行药典以氧化苦参碱和苦参碱含量及其他常规鉴别项目作为控制苦参质量的手段和指标6，但单一成分并不能全面地反映药材质量。近年来，已有苦参指纹图谱的研究报道7，这些研究主要对野生苦参的指纹图谱建立的方法与评价做了研究。对于栽培苦参的化学成分指纹图谱以及与野生苦参的对比研究还未见报道，本文采用 HLPC 方法，对不同产地野生、人工栽培的苦参药材进行分析，建立化学成分指纹图谱，对苦参样品的指纹图谱进行评价比较，比较不同产地的苦参和人工栽培的苦参化学指纹图谱，为苦参的质量控制提供参考。1 仪器与材料1. 1 仪器与试剂Ultimate 3000 戴安高效液相色谱仪( 美国戴安公司)，二极管阵列检测器(DAD)，色谱柱 C18(150 mm 6. 4 mm)，手动进样器，电子分析天平，Anke TDL-40B 离心机，隔膜真空泵及溶剂过滤器。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为重蒸馏水。苦参对照药材(121019-200304)，氧化苦参碱标准品(110780-200405)购自中国药品生物制品检定所。1. 2 样品及预处理收集河北承德、河南卢氏、甘肃成县的 3 份苦参野生药材，甘肃岷县的 5 份苦参栽培品材料，甘肃酒泉的 5 份苦参栽培品材，甘肃榆中的 6 份苦参栽培品材料。实验用苦参野生药材和栽培药材经甘肃农业大学药用植物系蔺海明研究员鉴定均为豆科槐属植物苦参(Sophora flavescens Ait)的根。所有样品见表 1。将各干燥的苦参样品粉碎，置于干燥器中保存，备用。表 1 20 批苦参药材样品来源编号 药材来源 编号 药材来源1 对照药材 11 甘肃酒泉 2 年生2 甘肃岷县产 1 年生 12 甘肃酒泉 2 年生3 甘肃岷县产 2 年生 13 甘肃酒泉 2 年生4 甘肃岷县产 4 年生 14 甘肃酒泉 2 年生5 甘肃岷县产 5 年生 15 甘肃榆中 2 年生6 甘肃岷县产 2 年生 16 甘肃榆中 2 年生7 甘肃成县野生 17 甘肃榆中 2 年生8 河北承德野生 18 甘肃榆中 2 年生9 河南卢氏县野生 19 甘肃榆中 2 年生10 甘肃酒泉 2 年生 20 甘肃榆中 2 年生2 数据处理SPSS (13. 0) 统计分析软件;国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004 版)软件。3 结果与分析3. 1 色谱条件的优化确定苦参药材主要有效成分为苦参类生物碱，综合考虑所要检测的苦参生物碱类化合物的极性，同时为确保所有成分能在一个色谱条件下均被洗脱，流动相 A 选用乙腈，流动相 B选用水的二元体系对苦参样品进行梯度洗脱，梯度程序以100% 乙腈结束8。本实验优化后的梯度洗脱程序见表 2，流速0. 5 mL/min。二极管阵列检测器(DAD)，比较200 nm，535的代表性。表 5 20 批样品指纹图谱相似度分析样品号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 201 1 0. 959 0. 971 0. 967 0. 966 0. 958 0. 992 0. 994 0. 983 0. 988 0. 983 0. 985 0. 980 0. 984 0. 981 0. 975 0. 979 0. 964 0. 973 0. 9822 0. 959 1 0. 932 0. 934 0. 931 0. 965 0. 963 0. 975 0. 966 0. 973 0. 967 0. 952 0. 947 0. 966 0. 984 0. 983 0. 984 0. 918 0. 939 0. 9423 0. 971 0. 932 1 0. 999 0. 999 0. 967 0. 979 0. 987 0. 986 0. 977 0. 977 0. 992 0. 987 0. 983 0. 961 0. 968 0. 971 0. 977 0. 989 0. 9904 0. 967 0. 934 0. 999 1 0. 999 0. 968 0. 978 0. 986 0. 986 0. 975 0. 979 0. 992 0. 989 0. 982 0. 957 0. 967 0. 970 0. 981 0. 990 0. 9895 0. 966 0. 931 0. 999 0. 999 1 0. 967 0. 977 0. 985 0. 986 0. 975 0. 976 0. 991 0. 986 0. 983 0. 959 0. 965 0. 969 0. 976 0. 988 0. 9896 0. 958 0. 965 0. 967 0. 968 0. 967 1 0. 974 0. 979 0. 985 0. 989 0. 984 0. 980 0. 970 0. 985 0. 977 0. 989 0. 987 0. 946 0. 967 0. 9707 0. 992 0. 963 0. 979 0. 978 0. 977 0. 974 1 0. 993 0. 991 0. 991 0. 993 0. 991 0. 990 0. 988 0. 982 0. 978 0. 983 0. 983 0. 988 0. 9918 0. 994 0. 975 0. 987 0. 986 0. 985 0. 979 0. 993 1 0. 991 0. 989 0. 992 0. 992 0. 991 0. 988 0. 983 0. 989 0. 990 0. 982 0. 989 0. 9919 0. 983 0. 966 0. 986 0. 986 0. 986 0. 985 0. 991 0. 991 1 0. 988 0. 989 0. 988 0. 984 0. 992 0. 982 0. 986 0. 988 0. 970 0. 987 0. 99210 0. 988 0. 973 0. 977 0. 975 0. 975 0. 989 0. 991 0. 989 0. 988 1 0. 996 0. 991 0. 982 0. 996 0. 988 0. 990 0. 991 0. 960 0. 976 0. 98011 0. 983 0. 967 0. 977 0. 979 0. 976 0. 984 0. 993 0. 992 0. 989 0. 996 1 0. 994 0. 991 0. 998 0. 981 0. 986 0. 986 0. 966 0. 985 0. 98312 0. 985 0. 952 0. 992 0. 992 0. 991 0. 980 0. 991 0. 992 0. 988 0. 991 0. 994 1 0. 994 0. 993 0. 975 0. 980 0. 982 0. 977 0. 990 0. 98913 0. 980 0. 947 0. 987 0. 989 0. 986 0. 970 0. 990 0. 991 0. 984 0. 982 0. 991 0. 994 1 0. 985 0. 965 0. 970 0. 973 0. 988 0. 997 0. 99114 0. 984 0. 966 0. 983 0. 982 0. 983 0. 985 0. 988 0. 988 0. 992 0. 996 0. 998 0. 993 0. 985 1 0. 984 0. 989 0. 989 0. 960 0. 980 0. 98515 0. 981 0. 984 0. 961 0. 957 0. 959 0. 977 0. 982 0. 983 0. 982 0. 988 0. 981 0. 975 0. 965 0. 984 1 0. 993 0. 995 0. 948 0. 961 0. 97416 0. 975 0. 983 0. 968 0. 967 0. 965 0. 989 0. 978 0. 989 0. 986 0. 990 0. 986 0. 980 0. 970 0. 989 0. 993 1 0. 999 0. 947 0. 968 0. 97517 0. 979 0. 984 0. 971 0. 970 0. 969 0. 987 0. 983 0. 990 0. 988 0. 991 0. 986 0. 982 0. 973 0. 989 0. 995 0. 999 1 0. 955 0. 970 0. 97718 0. 964 0. 918 0. 977 0. 981 0. 976 0. 946 0. 983 0. 982 0. 970 0. 960 0. 966 0. 977 0. 988 0. 960 0. 948 0. 947 0. 955 1 0. 991 0. 98619 0. 973 0. 939 0. 989 0. 990 0. 988 0. 967 0. 988 0