免疫组化13.doc

2004级考题1.简述原位杂交组织化学的基本原理。P841.核算的化学组成与基本结构2.DNA的变性与复性1）DNA变性：指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性温度：热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。影响Tm的因素：DNA的均一性，DNA分子中的（G+C）含量：溶剂的性质(低离子强度，Tm低；高pH；变性剂甲酰胺)2)复性:指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋结构.复性的影响因素。温度;DNA浓度;DNA片段长度;DNA分子的复杂性;离子强度。2.简述免疫组化染色ABC法的基本原理。P52生物素为含硫的杂环单羧酸，分子量小, 通过羧基与蛋白质的氨基结合，从而可标记抗体和酶。亲和素又称卵白素，是一种糖蛋白，生物素与亲和素有很高的亲和力1个亲和素分子上有4个生物素结合位点。在ABC法中，不对特异性第一抗体进行标记，而用生物素标记第二抗体，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC混合物，并使亲和素分子上至少空出一个生物素结合位点。染色时标本中的抗原先与第一抗体结合，后者在于生物素标记的第二抗体结合，然后加入ABC复合物，结合到第二抗体的生物素上，最后形成的复合物网络了大量的酶分子，因此敏感性更高。3.组织块进行固定的原理是什么?常用的固定方法和固定剂有哪些?P101.原理：应用固定剂使其替代组织中水的位置，并使组织中的蛋白质凝固，使组织小的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败。2常用的固定方法：1）浸润法：一次要处理许多组织样品时也多用此法。预先需估计固定剂的用量，并在取材前配好固定液，分装于小容器内，在容器上标记组别和取材时间。2）灌流固定法：此法是经血管途径，将固定液灌注到欲固定的器官内，使生活的细胞在原位及时迅速固定，取下组织之后再浸入相同的固定液内继续固定。3常用固定剂：1）甲醛2）丙酮3）醇类4）混合固定剂：bouin液，zamboni液，AFF液，5）甲醇6）乙醇7)4%多聚甲醛磷酸缓冲液8）乙醚或三氯甲烷4.何为细胞培养术?举例说明其在生物学医学研究中的应用.5.细胞凋亡的形态学检测方法有哪些?一、普通光学显微镜观察方法 （一）苏木素伊红染色（HE 染色法） （二）甲基绿派诺宁染色法 （三）Giemsa 染色 （四）瑞氏（ Wright ）染色 二、透射电子显微镜观察方法 三、荧光显微镜观察方法 （一）吖啶橙染色法 （二）Hoechst33258 染色法 （三）Hoechst33342 染色法6.何为色温?在显微摄影中常用日光型胶片在灯光下拍照,您将用何种方法调节色温?P184色温: 是指色质，即白光的程度。所谓白光，就是日光、灯光、天空光等。应使用青蓝色滤色镜。7.何为像素？在数码摄影中常考虑的参数是什么？P136;P198像素是构成显示器图像的最基本单元，按行和列（X和Y）方向排列成矩列。任何一矩列均对应一个点，这些点称为像素。像素、灰度、色彩、光密度、长度、面积8.酶标抗体免疫细胞化学间接法的基本原理是什么？此法的优缺点是什么？按此方法选择抗体时应注意什么问题？P51原理：第一抗体（兔）不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物（羊），制备抗抗体，即第二抗体（羊抗兔），并标记第二抗体。染色时，顺次以第一抗体和标记的第二抗体处理标本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗体-标记第二抗体复合物，以达到检测该抗原的目的。间接法因第二抗体的放大作用敏感性大大增高优点：特异性强、敏感度高、应用广泛。缺点较为复杂，速度慢应选用特异性强比活度高的抗体。2007级考题1.简述形态学研究有哪些主要常用技术？这些技术能解决哪些问题？2.何谓免疫荧光染色，用何种方法消除非特异荧光？P44;P74将荧光素作为标记物，通过免疫学和组织化学的原理对组织或细胞中的大分子物质进行定位、定性和定量的技术。动物脏器粉末吸收法、透析法葡萄糖凝胶G-50柱层析法3.ANN VASSAY检测细胞凋亡的原理、试验流程和结果分析。答：原理：主要是根据细胞凋亡过程中的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin-V是一种35-36KD的钙离子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，还会加一种DNA染料，常用的有P1。由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。试验流程：1）细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而贴壁细胞先用滴管轻轻吹打。凋亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02%的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（1-5）106，5001000r/min离心5min弃去培养液。2）用孵育缓冲液洗1次，5001000r/min离心5min。3）用100l的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育1015min。4）5001000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。5）加入荧光溶液4下孵育20min，避光并不时振动，上机检测。6）流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm透带滤器检测FTTC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测P1。 结果分析：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如P1有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被P1着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期P1不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。4.何谓像素？简述数码相机摄影的基本原理。P198像素是构成显示器图像的最基本单元，按行和列（X和Y）方向排列成矩列。任何一矩列均对应一个点，这些点称为像素。传统摄影是靠胶片上银盐的光化学反应来记录通过光学镜头的影像，而数码摄影是将通过光学镜头的影像信号转化为可由电脑处理的数码信息（即数字信息）。它记录影像不使用传统的感光材料胶卷，而采用CCD等影像传感器来接受影像信号。1.影像传感器（1）CCD意为“光电耦合元件”常见数码相机的CCD是由数百万只微型光电二极管构成，通常排列成小面积的长方形，在CCD上每一只光电二极管都能记录下投射到它表面的光线强度，所以每只光电二极管即为一个像素, 构成影像的最小单位。（2）CMOSCMOS（意为“互补型金属氧化物半导体”。CMOS传感器的集成度高，可以把许多电路集成在单一芯片上。2.镜头焦距和数码变焦（1） 镜头焦距：在数码相机中镜头焦距是指镜头中心至影像传感器平面的距离。（2）数码变焦：数码变焦实质上是在镜头原视角的基础上，在成像的CCD影像信号范围内截取一部分影像进行放大，使影像达到充满画面的效果。3.相当感光度4.白平衡白平衡功能是一种针对不同光照环境的颜色纠正功能，是让白色的物体在不同光照环境下依然呈现白色的功能。它的作用类似传统相机彩色摄影中校正色温滤光镜，用以获取准确的色彩还原。5.液晶显示屏6.连拍延迟7. 储存媒介8.图像文件的储存格式5.影响曝光的因素有哪些？什么情况下使用光圈优先？什么情况下使用快门优先？什么情况下考虑胶片的感光度或相当感光度？P180影响因素有光圈、快门和胶片感光度需要镜头的分辨率和影像反差均处于最佳状态时使用光圈优先需要较大景深时选用快门优先在光线强弱对拍摄影响很大的情况下考虑感光度6简述广义的组织化学均包含那些主要采用技术？这些技术能解决科研中的哪些问题？广义的组织化学包括传统的组织化学，免疫组织化学、电镜组织化学、免疫电镜组织化学和原位杂交组织化学。组织化学用于检测细胞内核酸脂类糖类和酶类等应用很广。免疫组织化学由于特异性强敏感度高所以应用广泛，凡是组织或细胞中能作为抗原或半抗原的物质，如蛋白质，多肽氨基酸多糖磷脂受体酶急速核酸记病原体都课用相应的特异性抗体进行检测，因此成为生物医学各学科领域的重要研究手段。1）电镜组织化学主要用于检测一些酶的活性及其在超微结构的定位虽然目前已知酶的种类超过2200余种蛋电镜只能观察100种，其原理是酶组织化学反应过程，酶底物反应的特异性，捕捉反映（金属盐城点发嗜锇性物质生成法。2）免疫电镜是根据抗原与抗体特异性结合的原理，利用电子密度标记抗体或经免疫化学反应能产生高电子产物的标记抗体在超微结构水平对抗体进行定性定位。3）原位杂交是将分子杂交技术与组织化学相结合而在核酸原有的位置上进行细胞内核酸定性定位的一种技术。更多用于定位细胞内mrna它可为研究单一细胞中编码各种蛋白质和多肽（前体）的相应MRNA 定位以及研究细胞内基因表达有关因素的调控提供有效地手段另外像遗传学病毒学神经内分泌学病理学免疫学及发育生物学等个领域7疫荧光组织化学的基本原理方法？免疫荧光组织技术是用免疫荧光技术检测细胞或组织内抗原或半抗原物质的方法。根据抗原抗体反应原理，先将已知抗体或抗原标记荧光素制成标记物，再用这种银光标记物作为分子探针与组织细胞内的相应抗原或抗体反应，在细胞或组织中形成含有荧光素的特异性抗原抗体复合物，这种复合物上的荧光素受激发光发射照射而发出各种颜色，荧光利用荧光显微镜观察，即可对组织细胞中的抗原进行定性定位乃至定量研究。蛋白质多肽核酸酶激素磷脂多糖受体记病原体等，凡能作为抗原或半抗原的物质均可用免疫荧光技术检出。8滤片的种类和用途？(1)激发光滤光片位于光源和显微镜之间的光路内其作用是吸收可见光，允许一定波长的紫外光和蓝紫光通过。根据观察需要，可将抹一些激发滤片至于光路使一定的光通过，作为荧光激发样品中的荧光物质。(2)阻断滤片又称吸收滤片在目镜和武警之间的光路中吸收视野内未被标本内荧光物质吸收的激发光，已获得清楚地荧光影像和保护观察者的眼睛（3）反光镜上有一层滤片对紫外线和可见光的蓝紫光吸收少反射率大90%以上，可折射激发光改变光路是激发光照入样品中。（4）隔热滤片吸收热量保护其他光学元件。（5）中性滤片可不同程度的吸收可见光，减弱光强度。9激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。10.免疫组织化学染色常见的脱片原因？及防脱片的处理步骤？脱片原因组织固定脱水透明不充分，组织切片过厚，组织切片有折叠，过度的热抗原修复（高压微波水煮）处理或抗原修复液的PH偏离炒作观察中冲洗方法不正确。防脱片用重鉻酸浓硫酸清洁液浸泡载玻片或则培养用的小盖片，然后用清水充分再用蒸馏水冲洗3遍以上后置95%乙醇12小时去除擦干或烤干清洁液浸泡只需2小时。检查玻片是否上胶。把玻片放入用配好的多聚左旋赖氨酸0.01%溶液中数十秒沥干于室温下12-24小时时候后的多聚L-懒氨酸放在4度的冰箱保存反复使用一个月。11.sp法（链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶）与直接免疫荧光法的区别？链霉亲和素替代ABC法中的亲和素-生物素复合物，形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法，SP法 链霉亲和素是从链霉菌中分离出的一种蛋白，含有四个亚基，链霉亲和素的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合，故又称链霉菌抗生物素蛋白；由于该放大系统不含生物素，可以免除由内源性生物素所造成的背景染色； 等电点为5.56.7，接近中性，所带的负电荷少； 链霉亲和素不含糖基。12何为二次展片? 是指切片在展片过程中，先将组织切片漂浮在30%的乙醇溶液中，进行第一次展片后将切片捞起，再次放入45一50 的水浴锅中进行第二次展片，因为酒精溶液与水之间有一个张力差，这样处理可得到平整无皱折的组织切片。酒精的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低，自行调整。核酸分子杂交:两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原理形成双链核酸的过程.13原位杂交组织化学技术进展？原位PCR技术 、荧光原位杂交技术 、胚胎原位杂交技术 、双重和多重原位杂交技术 、原位杂交结合免疫组织化学技术 、电镜原位杂交技术 、肽核酸原位杂交 14原位PCR技术原理将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。根据在扩增反应中所用的dNTP或引物是否标记，原位PCR可分为：直接法原位PCR、间接法原位PCR15免疫组织化学染色样品制备特点 取材： 组织标本取材：基本原则: 取材速度要快，尽量保持组织新鲜，以充分保存组织的抗原性。细胞标本取材贴壁生长细胞: 取材时，用预热的PBS轻轻冲洗小盖片，而后，即可加入固定液。 悬浮生长的细胞：制备210 5-6细胞/ml悬液，取50-100l，加入涂片机内，1000r/min. 2min. 细胞即可均匀分布在载玻片上3）涂片法： 临床穿刺获取含有细胞的液体（腹水，胸水和心包液）或气管、宫颈等分泌物可直接涂片。 固定： 组织常用固定剂： 10%中性缓冲福尔马林（浓甲醛10ml, 0.01M, pH 7.4, PBS 90ml) 4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)sp法注意事项：甲醛固定可引起组织抗原决定簇交联和封闭（可以通过抗原修复方法来修正 组织大小应该小于2cml.5cm 0.3cm，尤其厚度必须小于0.3cm；固定液的量，体积一般大于组织20倍以上；固定时间8-24小时，过度固定会使抗原表达假阴性；组织固定后应充分水洗。 16影响杂交体稳定性的因素杂交双链的碱基组成.杂交双链的长度.碱基错配程度.离子强度.变性剂浓度l类型核酸分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交组织化学(ISH)：应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。可进行细胞内核酸定性、定位的一种技术。核酸分子探针 ：一种带有标记物的、已知的、仅与靶分子特异反应的分子。探针的种类DNA探针cRNA探针寡核苷酸探针原位杂交组织化学基本程序标本制备杂交前处理 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号。免疫组织化学染色步骤石蜡切片免疫组化染色步骤1.烤片：58 2-h；2.脱蜡和水化：在二甲苯、中浸泡15min100酒精、中分别浸泡5min95、90、80、70酒精各浸泡2minPBS洗3次3min,置蒸馏水中待用；3.抗原修复：先将pH=6.0和0.1molL柠檬酸缓冲液煮沸，将切片置于已沸缓冲液中进行高压修复1.5min，室温冷却，PBS冲洗3次5min；4.用0.1 0.3TritonX-100浸泡，RT，25min，PBS冲洗3次5min；使抗体渗透进入细胞的方法Triton X-100 ：使细胞膜脂类溶解 （2） Np-40：使细胞膜蛋白质破环 （3） Saponin：使细胞膜胆固醇溶解（4） Freezing：使细胞膜穿孔，速冻形成冰晶，溶解后形成小孔。17免疫组织化学染色结果评价对照实验方法和结果分析对照种类靶组织实验试剂 阳性反应意义阳性组织对照组织中含待测抗原按常规操作流程提示操作系统的试剂和操作方法无误一抗阴性对照组织中待测抗原未定用与第一抗体相同种属正常血清取代一抗或用PBS取代一抗，其余步骤不变。提示有非特异性反应存在二抗阴性对照组织中待测抗原未定 用与第二抗体相同种属正常血清取代二抗或用PBS取代二抗，其余步骤不变。提示一抗对组织有非特异性吸附或组织内未灭活内源性酶18免疫组织化学技术应用的基本原则?免疫组织化学技术的局限性： 组织细胞内的待测物质要有抗原性； 有一定浓度方可检测出； 检测出的阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白。确定细胞类型和形态2辨认细胞产物的来源3确定细胞的分化程度4追踪神经纤维束和它的投射区5. 在临床病理中的应用 如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后，辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。19.流式细胞术在组织化学与免疫组织化学中的应用 ?流式细胞术的常用样品制备方法 单层培养细胞单细胞悬液的制备 实体组织单细胞悬液的制备机械法酶处理法 石蜡包埋组织的流式细胞样品制备 免疫荧光标记样品 直接免疫荧光标记法 间接免疫荧光标记法 荧光标记中的注意事项?细胞分选或检测细胞存活率时，要保持细胞新鲜标本的保存和固定：未染色培养细胞可常规冻存。不需排除死细胞可进行染色前固定。若要排除死细胞、染色后长时间存放、或标本具有传染性，需要染色后固定。阴性对照细胞非染色细胞：直接染色法时，用PBS代替荧光单克隆抗体。间接染色法时，PBS代替第一抗体和荧光第二抗体。同型对照：非特异性抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg）代替特异性单克隆抗体。选择与实验用单克隆抗体亚类一致的MsIg，即MsIgG或MsIgM。 直接染色法时，荧光结合MsIg代替荧光单克隆抗体。间接染色时，无荧光MsIg代替第一抗体。1何谓免疫荧光染色？荧光素有哪些？名字.发什么光、哪些与pro结合、哪些与DNA结合将荧光素作为标记物，通过免疫学和组织化学的原理对组织或细胞中的大分子物质进行定位、定性和定量的技术。异硫氰酸荧光素 黄绿荧光 蛋白质激发光 488nm； 最强发射波长 525nm,四甲基异硫氰酸罗丹明 橙红色荧光 蛋白质激发光550nm; 发射光620nm 四乙基罗丹明 橙红色荧光 蛋白质激发光570nm; 发射光595600nm 花青类染料 Cy2 绿色可见光激发波长为492nm，发光为波长510nm， Cy3 绿色荧光激发光波长为550nm，最强发射光为570nm ；Cy5 红色荧光 蛋白质激发光650nm 发射光670 nm 乙酸甲醇 可转化为乙酸甲酯 绿色荧光 钙荧光探针Indo-1 呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光，最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm量子点 颜色多种 吖啶橙染色 绿色荧光 DNA或RNAhoechst33258染色和hoechst33342 蓝色荧光 DNA染色激发光350nm，461DAPI 蓝色至青绿色 DNA染色358nm 激发，461nmGFP GFP的纯溶液在室内呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下，