免疫实验学技术.doc

酶联免疫斑点检测技术的应用 摘要：酶联免疫斑点检测（Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT）是一种在细胞悬液中定量检测细胞因子生成细胞的分析方法。本文主要从ELISPOT的技术原理及技术特点，标准的操作程序进行阐述，并对实验方法进行了介绍,展望了ELISPOT的应用。关键词:酶联免疫斑点检测；淋巴细胞；细胞培养 酶联免疫斑点检测（Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT），它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，分析经特异抗原活化后分泌细胞因子，如干扰素(interferongamma,IFN) 、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-) 等的单个效应细胞的频数, 具有敏感、特异、易于重复的优点 1 , 是检测抗原反应性效应细胞的最可靠实验方法之一 2 , 目前已成为抗原特异性T 细胞免疫学研究的主流技术。本文就ELISPOT 技术作如下综述。1 关于ELISPOT 酶联免疫斑点（ enzyme-linked immunosorbent spot， ELISPOT） 检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。 淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原或刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISPOT培养板中。这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISPOT培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（SPOT）。每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图象分析仪（BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析。该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况。2 ELISPOT技术原理和技术特点 ELISPOT结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。ELISPOT的培养板以聚偏二氟乙烯(PVDF)膜等为基质,包被上特异性单克隆抗体,在培养板孔内加入细胞培养基、待检测的细胞及抗原刺激物进行培养。在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下,T细胞分泌各种细胞因子,细胞因子被膜上的单克隆抗体捕获。被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合,然后用酶标亲和素与生物素进行化学酶联显色,在膜的局部形成一个个圆形斑点3 该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。其二，单细胞水平，活细胞功能检测。ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法。 实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。 在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs）。统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。3 ELISPOT的方法 由于有商品化的试剂盒，ELISPOT操作本身已经大大简化。目前的ELISPOT试剂盒按抗体的包被情况分为已包被板的和未包被板的两类。前者实验操作简单，但是背景较高，且价格较贵，所以应用不如后者广泛。按照ELISPOT底板材料分，可以分为PVDF膜板和非PVDF膜板。PVDF板由于疏水性的问题，需要用乙醇预先润湿，在洗涤过程中也更复杂一些。各个公司的试剂盒使用起来大同小异，我们以荷兰U-Cytech公司的PVDF板IFN-试剂盒，列出其操作方法。3.1 实验的准备工作（1） 设备与耗材：超净工作台；5% CO2 37C 细胞培养箱；Biosys ELISPOT ReaderP10，P200，P1000 微量移液器；P10，P200，P1000 枪头；0.5mL，1.5mL EP管。P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器；多道移液器吸槽；（2）溶液配制PBS：用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。PBST：PBS加入0.05% Tween-20，注意无菌操作。储存于20-25C，可存放一个月。70%乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。30%乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。包被抗体（coating antibody，Primary antibody）：加入双蒸水溶解。使用时，用PBS稀释50倍，每孔50L。封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液（Blocking stock solution R）稀释10倍，每孔200L。抗体稀释液：用PBS将试剂盒中的稀释存储液（Dilution buffer R）稀释10倍检测抗体（Biotinylated detector antibody，Secondary antibody）：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100L。酶联亲和素（Streptavidin-HRP conjugate）：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100L。AEC显色液： 照U-Cytech说明书，用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊（Substrate buffer capsule），然后加入3.3mL AEC储存液（AEC stock solution），混合均匀后10mL每支分装，-20oC保存。使用时，解冻，每孔加入100L。PHA刺激物： 将储存液（2mg/ml， Murex）分装成20L/EP管，-20C长期冻存。使用时，加入980L U-Cytech无血清培养基（或者1640基本培养基），成为工作液（40g/mL，10倍终浓度），每孔加入10L，终浓度4g/mL。U-Cytech无血清培养基：我们推荐无血清ELISPOT技术，它能排除血清的干扰，结果更加稳定可靠，背景也更好。如果没有，可以用含10%血清的1640培养基代替。3.2 ELISPOT标准操作程序3.2.1 ELISPOT包被程序 设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。每孔加入15L 70%的乙醇预湿30秒。未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的，经过乙醇润湿之后，颜色变暗，变成半透明状，很容易观察二者的区别。加乙醇的时候，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不到刺到PVDF膜。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。15L是经过优化的体积，它能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面，加深实验的背景。加入100L去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50L，4C包被过夜。（次日）倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。加入200L试剂盒自带的稀释好的封闭液，37C封闭1小时。倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4C保存，可以在4C保存数周。）3.2.2 铺细胞，加入刺激物，培养 整个实验设置一组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或者实验动物）要设一个负对照（不加刺激物），整块板还要加一个背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）。填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复（想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复）。取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，可以加入200L的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次。按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100L/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。正对照的细胞浓度为1x105/well，实验组的样品细胞浓度请自行调整。加入100L的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。正对照孔加入10L PHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-的分泌。加入实验者自己的刺激物（配制成10X终浓度，10L/well）到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀，实际上，通过扩散，刺激物也会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。 当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37C培养18-24小时。注意在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。为了取得更好的结果，甚至开关培养箱的箱门也应该禁止。因为碰撞会造成细胞的移位，造成斑点的模糊、拖尾。3.2.3 培养后操作 倾倒孔内的细胞及培养基。低渗法将细胞裂解，每孔加入200L冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。每孔用200LPBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干。按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100L生物素标记的检测抗体，37C 1小时。每孔用200L PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。 洗涤膜的背面，在一个浅托盘中盛上干净的PBST，将膜板的底面浸入，轻轻摇晃几次即可。一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后，再合拢，盖上，不要伤害到膜。按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100L，37C 1小时。每孔用200L PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100L的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，半点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。4 ELISPOT 技术的标准化与验证由于超高的灵敏度, ELI SPOT 结果易受到诸多因素影响,所以, 需要进行ELISPOT 技术的标准化与验证 11 。4. 1 ELISPOT 技术的标准化4.1.1 ELISPOT 板 Schielen 等4首先将PVDF 膜应用到ELISPOT 技术, 后来随着ELISPOT免疫沉淀反应( immuno r precipitation, IP) 及高通量筛选( high throughput screening ,H TS) 等板材的应用, 质量得到进一步的提高。塑料ELISA 板蛋白结合能力有限, 所以不建议使用。建议在一项研究中使用同一种板材, 最好为同一批次, 同时需要检查生产厂家的质量控制程序, 批次性能以及是否达到生物分子筛查协会( society for biomolecular sciences, SBS) 制定的标准。4.1.2 包被规程 使用PVDF 膜板, 预湿时每孔加入70%乙醇15L 以降低膜的疏水性。但乙醇必须被充分洗掉, 残留乙醇能干扰斑点形成。成对抗体的选择根据实验要求而定, 需要考虑抗体敏感性因素。不同商品试剂盒检测相同细胞因子的敏感性可相差10 倍, 所以需要进行标准化, 其中的一个重要参数是包被抗体的总量, 一般认为每孔约0.5-1.0g 包被抗体可以得到理想的斑点。4.1.3 细胞准备 (1)细胞分离: 因为红细胞溶血和血小板分泌的抑制因子能影响T 细胞功能, 所以, 必需进行PBMC 的分离。 (2)冻存、贮藏和运输: 冻存在细胞处理过程中最为关键。细胞的冻存有多种方法, 自动控制降温器可以提供逐步智能降温, 这在细胞最佳冻存及其标准化程序中是必需的; 经济实用的方法是使用装有异丙醇的冻存盒。血液样本处理, 分离及冻存的最佳时间范围应该在8h内或在采集当天完成, 样本放置时间过长或在不合适的温度下过久, 会影响PBMC 的功能, 甚至可造成IFN-斑点形成细胞减少5 倍以上。运输PBMC 的最佳方式是专用的冷冻液氮装置, 液氮缓慢挥发使气态氮充满运输容器, 使样本可在接近- 140的恒定温度下保持10-18d。不断变化的温度会对细胞功能造成致命影响, 不推荐用干冰运输盒运送标本。 (3)细胞复苏: 细胞复苏时应用DNA酶能提高细胞的产量并降低细胞团块形成 5 , ELISPOT 技术分析前最好将PBM C 放置过夜, 使有凋亡倾向的细胞死亡, 这样在分析前就可以估计出活力细胞的确切计数6 。4.1.4 刺激抗原 重组蛋白可以用来检测CD4+ T 细胞介导的反应, 对CD8+ T 细胞介导的反应有限。对重组蛋白的反应依赖于抗原呈递细胞( antien presenting cell, APC) , APC 细胞在冻存后数量减少, 同时重组蛋白在不同贮藏温度下会出现溶解性和稳定性的问题。活的重组病毒载体或病毒感染细胞株也有相似的优缺点。重叠多肽池能用来鉴定CD4+ 和CD8+T 细胞识别的最佳表位。肽段越短, 重叠越多, 鉴别组织相容性复合体( major histo compat ibility complex, MHC)-表位时越精确, 而不需要考虑可能的MHC-类反应, 因为MHC-位的氨基酸序列长度相对较长。所以检测MHC-表位( CD8+ T 细胞反应) 、MHC-表位( CD4+ T 细胞反应) 时在考虑合成肽价格的同时需要找到一个理想的平衡点。另外使用多肽时需要注意多肽的纯度, 以降低非特异细胞因子的产生。4.1.5 细胞计数 ELISPOT 技术在细胞数量上需要很高的准确性, 同时最小化死细胞数量也很重要, 死细胞可影响分析的正确性。常用台盼蓝排斥试验和对丝裂原的反应来判断复苏后PBMC 的质量。但Sm ith 等7 试验表明检测细胞的凋亡在判断细胞活力方面更有效, 当凋亡小于18%时可以得到理想结果。目前已有自动化设备用来进行细胞计数以及细胞活力检测。4.1.6 洗涤及斑点形成 洗涤程序可以采用手工, 也可以使用自动洗板机。大批量洗涤时, 手工需要很长时间, 从而造成孵育时间不一致。另外, 手工洗涤时, 如果缓冲液过少或压力过低就不能完全移除细胞和试剂, 从而造成膜上的假相斑点增多以及孔的周边颜料聚集。因此, 建议使用自动洗板机, 它至少可以使用2 种不同的洗涤缓冲液, 且能调整清洗探针的高度和缓冲液的流量。斑点的形成与ELISA 相似, 正确的成对抗体及其浓度必须通过实验验证后加以选择, 最佳的抗体量需要参考生产厂家的要求。对于亲和素酶复合物也必须给予重视,不同批次间的酶变异性要小, 以保证实验的可比性。底物的选择能够影响斑点的检测数量, 针对同一种酶的不同底物以及不同厂家生产的同一底物可能在敏感性上不同, 从而造成斑点计数产生相当大的差别8 。4.1.7 ELISPOT 板判读 使用显微镜计数斑点的方法费时、费力, 结果依赖个人经验, 产生偏差和较大变异的问题不可避免。使用自动读板机可明显降低计数时的变异性9 。Curr ier等10使用自动读板机时通过23 个8-11 肽组成的肽池，如鸡胚成纤维细胞( chickenembr yo fibr oblast, CEF) 肽池 来确定斑点的参数设置标准, 它们可以被CD8+ T 细胞识别并被类人类白细胞抗原( human leuko cyte antigen, HLA)A 和HLAB 等位基因呈递, 形成的斑点代表记忆性CD8+ T 细胞反应。Janetzki 等11实验表明使用CEF 肽池的控制方法时预设读板参数能获得变异性更小的结果。4. 2 ELISPOT 技术的验证 ELISPOT 技术的验证必须在开始临床试验前进行, 验证时应首先确定分析中可能出现问题的变量( 如: 孵育时间、试剂纯度及试剂浓度等) , 并随后在国际协调会议( inter national conference on harmonisation, ICH ) 文件ICH-Q2A 和ICH-Q2B 的指导下对整个操作规程进行验证。针对一个标准作业程序( standard operation procedure, SOP) 的验证过程应该包括: 准确性、精确性、特异性、检出限界、定量限界、线性及检测范围。5 ELISPOT技术的应用与展望 ELISPOT技术的独特优点已经让它在抗原特异性T细胞免疫学研究上独占鳌头。它是当今唯一能够检测到到百万分之一阳性细胞率的检测技术。如此高的灵敏度就连流式细胞技术，细胞内细胞因子染色和tetramer技术也望尘莫及12。此外由于淋巴细胞的冻存复苏问题也得到了完美的解决，经过冻存复苏的细胞并不丧失免疫功能13。这一点对临床试验非常重要，它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样。如果试验牵涉全国乃至全球多个临床试验机构，病人血样可冻存、运输到到核心实验室仪器检测。同理，一个实验样品或标准对照品可分装冻存，运输到不同的实验室检测，以资比较。所以，ELISPOT技术的应用在国外已经完全普及。凡是需要进行免疫学检测的地方机会都可以应用该项技术。ELISPOT 技术目前得到了广泛的应用, 其涉及范围包括:AIDS、癌症、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植方面的研究; 感染性疾病的免疫监测; 疫苗的研发与检测; 免疫显性表位的鉴定等14-19ELISPOT 技术在医学研究方面所受的限制不在于技术本身,而在于人们的想象力与创新思维, 客观地说, 在一切免疫学研究的前沿领域, ELISPOT 技术都是最有力的研究工具之一。参考文献 1 Cox JH , Ferra ri G, Janetzki S. 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