mmlv逆转录酶改造小结.docx

逆转录pcr是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。由一条RNA单链转录为互补cDNA称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。对于检测试剂来说，灵敏性非常重要。逆转录pcr过程中，RNA存在二级结构将严重影响反应的灵敏性。提高逆转录pcr灵敏性的方法很多。可以通过提高逆转录酶的反应温度，使RNA二级结构打开，利于引物结合，并能减少非特异性扩增。可以通过去除逆转录酶的RNAseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链，不利于逆转录的进行。还可以通过添加促进逆转录的添加剂。莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶是逆转录pcr常用的酶。由671个氨基酸组成，分子量约为75000道尔顿。分子空间结构包括5部分：手指区、手掌区、拇指区、连接区、RNAse H活性区。手指、手掌包括24-275号氨基酸. 拇指区和连接区分别是 276-361和362-474号氨基酸。手指区提供模板-引物结合位点，拇指区与底物结合同时提供持续合成的能力；连接区连接RNAse H活性区与拇指区，维持二者间构象的弹性。去除RNAse H活性区（H MMLV RT），不影响逆转录酶活性，并且具有更好的热稳定性。Asp524Ala, which is known to abolish the RNase H activity and increase the stability.要进一步提高H MMLV RT的反应温度，可以通过突变的方法。某些突变可以提高H MMLV RT的最适反应温度是因为这些突变提高了酶与模板-引物的结合能力。改变酶的带电性，增加正电荷，可以有效提高这种结合能力。已报道的突变点有Glu69, Gln84, Asp108, Asp114, Glu117, Glu123, Asp124, Glu286, Glu302, Trp313, Leu435, and Asn454。其中E69K,E302R, W313F,L435G,N454K （H M5）在55下保持30min仍然有50%的活性。文献报道现在可以达到的最高的逆转录温度是60，但突变位点没有公开。另，作为商品出售的mmlv逆转录酶逆转录温度达到70。海藻糖可以保护H MMLV，但是有效浓度是0.6M，对pcr有抑制作用。Tth聚合酶在Mn2+存在条件下可以作为逆转录酶，但是特异性很差。添加促进逆转录的添加剂，如二甲基亚砜，可以使RNA的二级结构打开，且不影响MMLV逆转录酶的活性，但浓度高于2%会使Taq酶的扩增出现非特异性。甘油可以提高H MMLV 逆转录酶的热稳定性，但对pcr有抑制作用。Invitrogen公司生产的SuperScript III 反转录酶在 50 下活性最高，可增特异性提高扩增效率。SuperScript VILO cDNA合成试剂盒通过平衡 逆转录酶、RNase 抑制剂、和加入的专有辅助蛋白，提高灵敏度以及cDNA产量，同时对下游 qPCR 的抑制作用更少。GLY SER HIS MET THR TRP LEU SER ASP PHE PRO GLN ALA TRP ALA GLU THR GLY GLY MET GLY LEU ALA VAL ARG GLN ALA PRO LEU ILE ILE PRO LEU LYS ALA THR SER THR PRO VAL SER ILE LYS GLN TYR PRO MET SER GLN GLU ALA ARG LEU GLY ILE LYS PRO HIS ILE GLN ARG LEU LEU ASP GLN GLY ILE LEU VAL PRO CYS GLN SER PRO TRP ASN THR PRO LEU LEU PRO VAL LYS LYS PRO GLY THR ASN ASP TYR ARG PRO VAL GLN ASP LEU ARG GLU VAL ASN LYS ARG VAL GLU ASP ILE HIS PRO THR VAL PRO ASN PRO TYR ASN LEU LEU SER GLY LEU PRO PRO SER HIS GLN TRP TYR THR VAL LEU ASP LEU LYS ASP ALA PHE PHE CYS LEU ARG LEU HIS PRO THR SER GLN PRO LEU PHE ALA PHE GLU TRP ARG ASP PRO GLU MET GLY ILE SER GLY GLN LEU THR TRP THR ARG LEU PRO GLN GLY PHE LYS ASN SER PRO THR LEU PHE ASP GLU ALA LEU HIS ARG ASP LEU ALA ASP PHE ARG ILE GLN HIS PRO ASP LEU ILE LEU LEU GLN TYR VAL ASP ASP LEU LEU LEU ALA ALA THR SER GLU LEU ASP CYS GLN GLN GLY THR ARG ALA LEU LEU GLN THR LEU GLY ASN LEU GLY TYR ARG ALA SER ALA LYS LYS ALA GLN ILE CYS GLN LYS GLN VAL LYS TYR LEU GLY TYR LEU LEU LYS GLU GLY GLN ARG TRP LEU THR GLU ALA ARG LYS GLU THR VAL MET GLY GLN PRO THR PRO LYS THR PRO ARG GLN LEU ARG GLU PHE LEU GLY THR ALA GLY PHE CYS ARG LEU TRP ILE PRO GLY PHE ALA GLU MET ALA ALA PRO LEU TYR PRO LEU THR LYS THR GLY THR LEU PHE ASN TRP GLY PRO ASP GLN GLN LYS ALA TYR GLN GLU ILE LYS GLN ALA LEU LEU THR ALA PRO ALA LEU GLY LEU PRO ASP LEU THR LYS PRO PHE GLU LEU PHE VAL ASP GLU LYS GLN GLY TYR ALA LYS GLY VAL LEU THR GLN LYS LEU GLY PRO TRP ARG ARG PRO VAL ALA TYR LEU SER LYS LYS LEU ASP PRO VAL ALA ALA GLY TRP PRO PRO CYS LEU ARG MET VAL ALA ALA ILE ALA VAL LEU THR LYS ASP ALA GLY LYS LEU THR MET GLY GLN PRO LEU VAL ILE LYS