工业微生物 第3章 微生物的营养与培养基.ppt

工业微生物 第三章微生物的营养与培养基 第一节微生物的营养 一 微生物的营养物质微生物在生长过程中 需要不断从外界环境吸收物质并加以利用 以获得能量和合成细胞物质 这个过程称为微生物的营养 而被微生物吸收和利用的物质 称为微生物的营养物质 一 微生物细胞的化学组成分析微生物细胞的化学组成 是研究微生物营养的基础 微生物细胞的元素构成由C H O N P S K Na Mg Ca Fe Mn Cu Co Zn Mo等组成 其中C H O N P S六种元素占微生物细胞干重的97 其他为微量元素 微生物细胞的化学元素组成的比例常因微生物种类的不同而各异 第一节微生物的营养 微生物细胞的化学成分主要以有机物 无机物和水的状态存在 有机物包含各种大分子 它们是蛋白质 核酸 类脂和糖类 占细胞干重的99 无机成分包括小分子无机物和各种离子 它们参与有机物组成或单独存在于细胞原生质内的无机盐等灰分中 占细胞干重的1 水是微生物细胞中含量最大的成分 不同种类的微生物含水量不同 细菌细胞的游离水含量平均为75 85 酵母菌约为70 80 霉菌约为85 90 同一种微生物的含水量随发育阶段和生活条件不同也有差别 第一节微生物的营养 二 微生物的营养物质微生物的营养物质种类繁多 自然界中也有成千上万种物质可被不同微生物利用 微生物生长所需要的营养物质主要是以有机物和无机物的形式提供的 小部分由气体物质供给 根据营养物质在机体中的性质和作用可分为 碳源 氮源 能源 生长因子 无机盐和水 第一节微生物的营养 1 碳源凡能提供微生物营养所需的碳元素的营养源称为碳源 碳元素是构成机体中有机物分子的骨架 约占细胞干重的50 同时碳元素也是大多数微生物的能源 微生物能够利用的碳源极其广泛 从简单的无机碳源到复杂的有机碳源 甚至高度不活跃的烃及人工合成的塑料都可被不同的微生物利用 表3 1 但不同的微生物利用含碳物质具有选择性 利用能力也有差异 对于异养微生物 最适碳源为 C H O 型 其中糖类是最广泛的 其次是醇类 有机酸类和脂类 第一节微生物的营养 表3 1微生物利用的碳源物质 第一节微生物的营养 实验室内常用的碳源主要有葡萄糖 蔗糖 淀粉 甘露醇 有机酸等 发酵工业生产实践中 常用的碳源是农副产品和工业废弃物 如 甘薯粉 玉米粉 饴糖 米糠 酒糟 造纸厂的废水等 将来 如果能够利用人类和动物不能食用的纤维素 石油和CO2等作为碳源来培养大量微生物 那会是一件很有意义的工作 第一节微生物的营养 2 氮源凡是可以被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质通称为氮源物质 自然界中能被微生物利用的氮源是十分广泛的 从分子态氮到有机态氮 氮源物质常被微生物用来合成细胞中含氮物质 少数情况下可作能源物质 如某些厌氧微生物在厌氧条件下可利用某些氨基酸作为能源 氮的来源可分为无机氮和有机氮 从分子态氮到结构复杂的含氮化合物 如硝酸盐 铵盐 氰化物 尿素 蛋白质及蛋白质降解产物等 都可以被各种微生物所利用 能利用无机氮的微生物种类较多 尤其是铵盐 几乎所有微生物都可利用 多数微生物也可利用有机氮 蛋白质 核酸 尿素 氨基酸 表3 2 第一节微生物的营养 表3 2微生物利用的氮源物质 第一节微生物的营养 许多微生物既可以利用无机氮化合物作为氮源 也可以利用有机含氮化合物作为氮源 例如土霉素生产菌在生产过程中既可以利用 NH4 2SO4 也可以利用玉米浆 黄豆饼粉作为氮源 而且对氮源的利用硫酸铵 玉米浆相对于黄豆饼粉的速度快 前者为速效氮源 后者为迟效氮源 速效氮源通常有利于机体的生长 迟效氮源则有利于代谢产物的形成 在工业发酵过程中 往往将速效氮源与迟效氮源按一定的比例制成混合氮源加到培养基里 以控制微生物的生长期与代谢产物形成期的长短 达到提高产量的目的 在实验室中常使用的有机氮源有蛋白胨 牛肉膏和酵母膏等 工业上常用硫酸铵和尿素 氨水 豆饼粉 花生饼粉 玉米浆 麸皮等原料作为氮源 第一节微生物的营养 3 能源能源是指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能 各种异养微生物的能源就是其碳源 化能自养微生物的能源常是一些还原态无机物 如NH4 NO2 S H2S H2 Fe22 等 微生物可利用其在化学反应中释放的化学能作为能源 光能营养微生物的能源是辐射能 微生物的能源谱归纳如下 第一节微生物的营养 辐射能仅供给能源 是单功能的 还原态无机养料如NH4 NO2 是双功能的 既能作能源又是氮源 有些是三功能的 同时作能源 碳源 氮源 有机物有的是双功能的 有的是三功能的 第一节微生物的营养 4 生长因子生长因子通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小 但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物 狭义的生长因子仅指维生素 广泛的生长因子除维生素外 还有碱基 卟啉及其衍生物 甾醇 胺类 C4 C6的分枝或直链脂肪酸等 根据生长因子的化学结构和它们在机体中的生理功能的不同 可将生长因子分为维生素 氨基酸与嘌呤和嘧啶三大类 维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢 表3 3 有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力 因此必须在培养基中补充这些氨基酸或含有这些氨基酸的小肽类物质 微生物才能正常生长 嘌呤与嘧啶作为生长因子在微生物机体内的作用主要是作为酶的辅酶或辅基 以及用来合成核苷 核苷酸和核酸 表3 3维生素及其在代谢中的作用 第一节微生物的营养 在配制培养基时 如果配制天然培养基 可加入富含生长因子的原料 如酵母膏 玉米浆 肝浸汁 麦芽汁 或其他新鲜的动植物组织液 如果配制的是组合培养基 则可加入维生素溶液 第一节微生物的营养 5 无机盐无机盐主要为微生物提供除碳源 氮源以外的各种重要元素 是必需和不可缺少的 根据微生物对化学元素需要量的大小 又可分为大量元素 生长所需浓度在10 3 10 4M 和微量元素 生长所需浓度在10 6 10 8M 大量元素 P S K Mg Ca Na Fe等微量元素 Cu Zn Mn Mo Co等无机盐在微生物机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分 维持生物大分子和细胞结构的稳定性 表3 4 调节并维持细胞的渗透压平衡以及控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等 第一节微生物的营养 第一节微生物的营养 表3 4无机盐及其生理功能 在微生物的生长过程中还需要一些微量元素 微量元素一般参与酶的组成或使酶活化 各种微量元素的生理功能见表3 5 如果微生物在生长过程中缺乏微量元素 会导致细胞生理活性降低甚至停止生长 微量元素通常混杂在天然有机营养物 无机化学试剂 自来水 蒸馏水 普通玻璃器皿中 如果没有特殊原因 在配制培养基时没有必要另外加入微量元素 值得注意的是 许多微量元素是重金属 如果它们过量 就会对机体产生毒害作用 而且单独一种微量元素过量产生的毒害作用更大 因此有必要将培养基中微量元素的量控制在正常范围内 并注意各种微量元素之间保持恰当比例 第一节微生物的营养 第一节微生物的营养 表3 5各种微量元素的生理功能 在配制细菌培养基时 对于大量元素来说 可以加入有关化学试剂 其中首选K2HPO4及MgSO4 因为它们可提供四种需要量最大的元素 对于微量元素 一般可在化学试剂 天然水 玻璃器皿或是其他天然成分中都可得到 故在配制培养基时不用单独加入 但在研究营养代谢时 要根据需要加入 第一节微生物的营养 6 水水是微生物细胞的主要组成成分 是微生物生存的基本条件 水在细胞中的生理功能主要有 a 起到溶剂与运输介质的作用 营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成 b 参与细胞内一系列化学反应 c 维持蛋白质 核酸等生物大分子稳定的天然构象 d 由于水的比热高 是热的良好导体 能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外 从而有效地控制细胞内温度的变化 第一节微生物的营养 二 微生物的营养类型由于微生物种类繁多 其营养类型比较复杂 根据碳源 能源及电子供体性质的不同 可将绝大部分微生物分为光能自养型 光能异养型 化能自养型及化能异养型四种类型 表3 8 第一节微生物的营养 第一节微生物的营养 表3 8微生物的营养类型 1 光能自养型光能自养型也称光能无机营养型 这是一类能以CO2为唯一碳源或主要碳源并利用光能进行生长的微生物 它们能以水 硫化氢 硫代硫酸钠等还原态无机物 使CO2固定还原成细胞物质 并且伴随元素氧 硫 的释放 藻类 蓝细菌 绿硫细菌等属于这种营养类型 第一节微生物的营养 藻类和蓝细菌含叶绿素 其光合作用与高等绿色植物一样 在光的作用下以水为氢供体 同化CO2并释放O2 紫硫细菌和绿硫细菌含细菌叶绿素 以H2S S等还原态硫化物作为氢供体 进行不放氧的光合作用 产生的元素硫或是积累在细胞中 或是分泌到细胞外 第一节微生物的营养 2 光能异养型光能异养型又称光能有机营养型 这类微生物利用简单有机物作为主要碳源和供氢体进行光合作用 合成细胞有机物质 与以CO2为唯一碳源的自养型不同的是 它们不能在完全无机的环境中生长 红螺属的一些细菌就是这一营养类型的代表 在有有机物存在的前提下 它们也能固定CO2 第一节微生物的营养 3 化能自养型化能自养型又称化能无机营养型 这类微生物利用无机物氧化过程中放出的化学能作为它们生长所需的能量 以CO2或碳酸盐作为唯一或主要的碳源进行生长 利用电子供体如氢气 硫化氢 二价铁离子或亚硝酸盐等使CO2还原成细胞物质 属于这类微生物的类群有硫化细菌 硝化细菌 氢细菌与铁细菌等 例如氢细菌 第一节微生物的营养 4 化能异养型化能异养型又称化能有机营养型 这类微生物生长所需的能量来自有机物氧化过程放出的化学能 生长所需要的碳源主要是一些有机化合物 如淀粉 糖类 纤维素 有机酸等 也即化能有机营养型微生物里的有机物通常既是它们生长的碳源物质又是能源物质 目前在已知的微生物中大多数属于化能有机营养型 如绝大多数的细菌 全部真菌 原生动物以及病毒 第一节微生物的营养 在许多情况下 同一物质即是碳源又是能源 氮源可以是有机氮化合物 也可以是无机氮 大部分生物都属于这种类型 化能异养型微生物又可根据它们获得养料的方式而分为腐生和寄生两大类 腐生菌能够以无生命的有机物作营养 寄生菌则只能从活体中吸取营养物质 寄生和腐生之间又存在中间类型 称兼性寄生或兼性腐生 第一节微生物的营养 三 营养物质的运输方式营养物质能否被微生物利用的一个决定性因素是这些营养物质能否进入微生物细胞 只有营养物质进入细胞后才能被微生物细胞内的新陈代谢系统分解利用 进而使微生物正常生长繁殖 微生物在吸收营养物质的时候 细胞膜具有很大作用 一般认为细胞膜以4种方式控制物质的运输 即单纯扩散 促进扩散 主动运输和基团移位 第一节微生物的营养 1 单纯扩散单纯扩散又称被动扩散 它是指被运送的物质依靠细胞内外的浓度梯度为动力 从浓度高的区域向浓度低的区域扩散直到平衡的过程 这个过程无载体蛋白参与 不消耗能量 运送的物质是气体 水及某些脂溶性物质 这是物质进出细胞最简单的一种方式 第一节微生物的营养 单纯扩散是一种最简单的物质跨膜运输方式 是一个纯粹的物理学过程 在扩散过程中不消耗能量 物质扩散的动力来自参与扩散的物质在膜内外的浓度差 营养物质不能逆浓度运输 物质扩散的速率随原生质膜内外营养物质浓度差的降低而减小 直至膜内外营养物质浓度相同时才达到一个动态平衡 此时运输速率为零 第一节微生物的营养 由于原生质膜主要由磷脂双分子层和蛋白质组成 膜内外表面为极性表面 中间为疏水层 因而物质跨膜扩散的能力和速率与该物质的性质有关 相对分子质量小 脂溶性 极性小的物质易通过扩散进出细胞 水是唯一可以通过扩散自由通过原生质膜的分子 脂肪酸 乙醇 甘油 苯 一些气体分子 O2 CO2 及某些氨基酸在一定程度上也可通过扩散进出细胞 单纯扩散没有特异性和选择性 扩散速度很慢 因此单纯扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式 第一节微生物的营养 2 促进扩散促进扩散指物质借助存在于细胞膜上的特异性载体蛋白的协助 顺浓度梯度进入细胞的方式 促进扩散与单纯扩散一样 也是以物质的浓度梯度为动力 不需要代谢能量 不同之处是促进扩散有膜载体 通透酶 参加 膜载体是位于膜上的蛋白质 把物质从膜外运至膜内 膜载体的外部是疏水性的 但是与溶质的特异性结合部位却是亲水的 载体亲水部位取代极性溶质分子上的水壳体 实现载体与溶质分子的结合 具有疏水性外表的载体将溶质带入脂质层 到达另一侧 由于在细胞外和膜载体的亲合力高 易结合 而进入细胞后 亲和力降低 所以溶质就在胞内被释放 由于膜载体的参与 促进扩散速度大于单纯扩散 第一节微生物的营养 通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸 单糖 维生素及无机盐等 一般微生物通过专一的载体蛋白运输相应的物质 某些载体蛋白质只转运一种分子 如葡萄糖载体只能运输葡萄糖 大多数载体蛋白只转运一类分子 如转运芳香族氨基酸的载体蛋白质不转运其他氨基酸 但也有微生物对同一物质的运输由一种以上的载体蛋白来完成 例如鼠伤寒沙门氏菌利用四种不同载体蛋白运输组氨酸 酿酒酵母有三种不同的载体蛋白来完成葡萄糖的运输 另外 某些载体蛋白可同时完成几种物质的运输 例如大肠杆菌可通过一种载体蛋白完成亮氨酸 异亮氨酸和缬氨酸的运输 但这种载体蛋白对这三种氨基酸的运输能力有差别 第一节微生物的营养 促进扩散通常在微生物处于高营养物质浓度的情况下发生 这种特异性扩散 常见于许多真核微生物中 如葡萄糖促进扩散进入酵母细胞 在原核生物中促进扩散比较稀少 但是发现甘油可以通过促进扩散进入沙门氏菌 志贺氏菌等肠道细菌 第一节微生物的营养 3 主动运输主动运输是指通过细胞膜上特异性载体蛋白构型变化 同时消耗能量 使膜外低浓度物质进入膜内的一种物质运输方式 主动运输的特点是被吸收的物质不受物质浓度梯度的制约而进入细胞 被运输的物质在细胞膜的外侧与膜载体的亲和力强 能形成载体复合物 当进入膜内侧时在能量的参与下 载体发生构型变化 与结合物的亲和力降低 营养物质便被释放出来 这样物质可以从低浓度向高浓度输送 第一节微生物的营养 主动运输过程和促进扩散一样需要膜载体的参与 并且被运输的物质与载体的亲和力改变也和载体蛋白型的改变有关 但是在主动运输过程中载体蛋白构型改变要消耗能量 而被运输的物质则不发生任何化学变化 由于这种方式可以逆浓度梯度将溶质输送到细胞里面 因此必须由外界提供能量 微生物不同 能源来源也不同 主动运输是微生物吸收营养物质的一种主要方式 很多无机离子 有机离子和一些糖类 乳糖 葡萄糖 麦芽糖等 是通过这种方式进入细胞的 对于很多生存于低浓度营养环境中的微生物来说 主动运输是影响其生存的重要营养吸收方式 第一节微生物的营养 4 基团移位基团移位是指被运输的物质在膜内受到化学修饰 以被修饰的形式进入细胞的物质运输方式 是一种即需特异性载体蛋白又需消耗能量的运输方式 但溶质在运送前后会发生分子结构的变化 这点不同于主动运输 基团移位主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细菌中 主要用于糖的运输 脂肪酸 核苷 碱基等也可通过这种方式运输 目前尚未在好氧型细菌及真核生物中发现这种运输方式 也未发现氨基酸通过这种方式进行运输 基团移位主要用于运送葡萄糖分子 果糖 甘露糖 核苷酸 丁酸和腺嘌呤等物质 上述4种运输方式的比较与模式图见表3 9和图3 1 第一节微生物的营养 第一节微生物的营养 表3 9四种营养物质运输方式的比较 第一节微生物的营养 图3 1四种营养物质进出微生物细胞的方式 一 培养基配制的原则 一 选择适宜的营养物质根据不同微生物的营养需要 配制不同的培养基 如配制自养型微生物的培养基完全可以由简单的无机物组成 而配制异养型微生物的培养基则至少有一种有机物 例如 培养细菌可采用牛肉膏蛋白胨培养基 培养酵母菌用麦芽汁培养基 第二节微生物的培养基 二 营养物质浓度及配比合适培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好 营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需 浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用 例如高浓度糖类物质 无机盐 重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长 反而起到抑菌或杀菌作用 另外 培养基中营养物质间的浓度配比特别是碳与氮或碳 氮 磷比要恰当 如利用微生物进行谷氨酸发酵 C N为4 1时 菌体大量增殖 C N为3 1时 菌体繁殖受抑制 而谷氨酸大量增加 第二节微生物的培养基 三 控制pH条件培养基的pH必须控制在一定的范围内 在实验室培养细菌与放线菌一般适于在pH7 7 5范围内生长 酵母菌和霉菌通常在pH4 5 6范围内生长 由于在培养微生物的过程中会产生有机酸 CO2和NH3 前两者为酸性物质 后者为碱性物质 它们会改变培养基的pH 所以 在培养基中需加入缓冲剂 如K2HPO4 KH2PO4 Na2CO3 NaHCO3 NaOH等 它们既起调节pH的作用 又可在培养过程中调整pH的改变 第二节微生物的培养基 二 培养基类型及应用培养基种类繁多 根据其成分 物理状态和用途可将培养基分成多种类型 一 按成分不同划分1 天然培养基天然培养基含天然有机物质 其化学成分复杂且难以确定 常用的天然培养基成分有 麦芽汁 肉浸汁 鱼粉 麸皮 玉米粉 花生饼粉 玉米浆和马铃薯等 实验室常用牛肉膏 蛋白胨 酵母膏等 天然培养基适合培养各类异养微生物 在重复性要求较高的实验中 应注意使用同一牌号同一批号的有机物试剂来配制培养基 以减少同成分差异而带来的误差 2 合成培养基合成培养基是用化学成分完全了解的物质配制而成的培养基 例如高氏一号培养基和查氏培养基就属于此类型 第二节微生物的培养基 二 根据物理状态划分根据培养基的物理状态 可将培养基分为固体培养基 半固体培养基和液体培养基三种类型 1 固体培养基在培养液中加入一定量的凝固剂 琼脂约2 或明胶5 12 使之凝固成为固体状态即为固体培养基 目前实验室用的凝固剂种类有琼脂 明胶和硅胶 现将琼脂 明胶主要特性列于表3 10中供比较 第二节微生物的培养基 第二节微生物的培养基 表3 10琼脂明胶主要特性比较 硅胶是由无机的硅酸钠 Na2SiO3 及硅酸钾 K2SiO3 被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体 对绝大多数微生物而言 琼脂是最理想的凝固剂 明胶是最早用来作为凝固剂的物质 但由于其凝固点太低 且易被一些细菌和许多真菌液化 目前已较少作为凝固剂 硅胶则因不含有机物 适合配制分离与培养自养型微生物的培养基 酸性很强的培养基也宜用硅胶作凝固剂 并将硅胶与培养液分开灭菌 降温后再混合 以免产生絮凝物 固体培养基常用来进行菌种的分离 鉴定 菌落计数与菌种保藏等 第二节微生物的培养基 2 半固体培养基在液体培养基中加入少量琼脂 一般为0 2 0 7 配制而成的培养基为半固体培养基 半固体培养基常用来观察细菌的运动能力 分类鉴定 各种厌氧菌的培养以及菌种保藏等 3 液体培养基液体培养基是由水加营养物质配制而成的培养基 主要用来进行各种生理 代谢等基础理论和应用方面的研究 第二节微生物的培养基 三 按用途划分1 基础培养基尽管不同生物的营养需求各不相同 但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的 基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基 牛肉膏