LC-MS联用技术在天然药物化学中的应用.ppt

18章LC MS和LC NMR联用在天然药物化学中的应用 报告者 谢凤 主要内容 1 高效液相色谱 HPLC 2 质谱 核磁共振 在天然产物分析中的应用 定性分析 混合物中已知化合物的结构分析 混合物中未知成分结构分析 定量分析 在天然产物分析中的应用 的应用 LC MS和LC NMR的应用前景 1高效液相色谱法 HighPerformanceLiquidChromatography HPLC 1 1高效液相色谱法的产生和发展 高压 高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世 导致高效液相色谱法 high performanceliquidchromatography HPLC 的产生 薄壳型填料 柱效仅每米1000 3000塔板数 5 10 m球型和无定型微粒硅胶 每米5 6万理论塔板数 高度均匀甚至单分散1 3 m硅胶基质球形填料 达15 30万理论塔板 m 新型分离模式和方法不断增加 1 2高效液相色谱法分类 1根据分离原理 1 吸附色谱 adsorptionChromatography 2 分配色谱 partitionChromatography 3 离子交换色谱 ion ExchangeChromatography 4 体积排阻色谱 sizeExclusionChromatography 2根据固定相和液体流动相相对极性的差别 1 正相色谱 固定相 流动相 2 反相色谱 固定相 流动相 1 3高效液相色谱仪 现代高效液相色谱使用3 10 m柱填料 为达到适用的流动相流速 高压泵需提供几十MPa或数百大气压力的柱前压 因而HPLC仪器比其他类型的色谱仪要复杂和昂贵 1 2 3 流动相溶剂储器 4 5 6 过滤器 7 溶剂比例调节阀和混合室 8 输液泵 9 脉动阻尼器 10 放空阀 11 过滤器 12 反压控制器 13 进样阀 14 色谱柱 15 检测器 1 3 1流动相贮器和溶剂处理系统 现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器 一般为玻璃瓶 亦可为耐腐蚀的不锈钢 氟塑料或聚醚醚酮 PEEK 特种塑料制成的容器 每个储瓶容积500 2000mL 储液瓶位置要高于泵体 以保持一定的输液静压差 在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排出 储器常装有脱除溶剂中溶解的氧 氮等气体装置 这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽 并干扰检测器正常工作 溶剂脱气主要有两种方法 其一是搅拌下真空或超声波脱气 另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中空气 储液器的溶剂导管入口处装有过滤器 以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣 防止损坏泵 进样阀或堵塞色谱柱 1 3 2高压泵系统 通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是 提供 50 500 105Pa的柱前液压 输出无脉动恒定的液流 流速范围0 1 10mL min 流速控制精度0 5 或更好 系统组件耐腐蚀 密封性良好的不锈钢或氟塑料 高压泵产生的液体高压没有爆炸危险 因为液体的压缩性极小 最重要的是系统密封性能好 目前常使用的有三种类型的输液泵 即往复柱塞泵 气动放大泵 螺旋注射泵 它们各有优 缺点 1 3 3进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多 约5 30cm 所以柱外展宽 又称柱外效应 较突出 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽 主要包括进样系统 连接管道及检测器中存在死体积 柱外展宽可分柱前和柱后展宽 进样系统是引起往前展宽的主要因素 因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严 进样阀 1 3 4高效液相色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件 它包括柱管与固定相两部分 柱管材料有玻璃 不锈钢 铝 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属 玻璃管耐压有限 故金属管用得较多 一般色谱柱长5 30cm 内径为4 5mm 凝胶色谱柱内径3 12mm 制备往内径较大 可达25mm以上 一般在分离前备有一个前置柱 前置柱内填充物和分离柱完全一样 这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和 使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相 保证分离技的性能不受影响 1 色谱柱类型按内径大小可大致分为常规分析柱 制备或半制备柱 小内径或微径柱 毛细管柱四种类型 2 保护柱一般在分析柱前装上较短的保护柱 不仅可除去溶剂中的颗粒杂质和污染物 而且可除去样品中含有与固定相不可逆结合的组分 以保护较昂贵的分析柱 延长使用寿命 3 柱恒温器对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留值和更好分离色谱图 4 柱填充技术根据填料粒径大小采用干法或湿法装柱 粒径大于20 m 采用类似气相色谱的干法装柱 实际上这种方法己很少使用 目前大多数采用10 m以下填料 以称为等密度匀浆湿法装柱 注 1 高压泵 2 压力表 3 排空气阀 4 匀浆罐 5 色谱柱 6 加压介质瓶 7 废液杯 1 3 5液相色谱检测器 在液相色谱中 有两种基本类型的检测器 一类是溶质性检测器 它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应 属于这类检测器的有紫外 荧光 电化学检测器等 另一类是总体检测器 它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应 属于这类检测器的有示差折光 电导检测器等 常用的检测器有 l 光吸收检测器 紫外吸收检测器 光二极管阵列检测器 红外吸收检测器2 荧光检测器3 示差折光率检测器4 蒸发光散射检测器5 电化学检测器 2质谱 质谱 指把带电荷的分子或经一定方式裂解形成的碎片离子按照核质比 m z 大小排列而成的图谱 特点与用途 灵敏度高 10 11g 分析速度快1 几秒 测定对象广 气体 液体 固体 用途 求精确分子量 鉴定化合物 推断结构 测Cl Br等原子数 2 1质谱仪 产生离子流 m z 1样品导入系统 被分析的试样通过进样系统进入质谱仪 使试样在不被破坏的情况下进入离子源 2离子源 分为电离室和加速室 试样在电离室被电离 在电离室出口 对离子施加一个加速电压 使电离的粒子进入质量分析仪 主要的离子源 电子轰击源 EI 化学电离源 CI 快原子轰击离子源 FAB 基质辅助激光解析电离源 MALDI 大气电压源 API 数据处理系统 3质量分析仪 为质谱仪的核心 可以把不同荷质比的离子分开 4检测器 检测各种质荷比的离子 不同类型的检测器检测的原理不同5 数据处理系统 进行数据的采集 存储 处理 打印 检索等 2 2质谱中的主要离子 一 分子离子 奇数个电子M eM 谱图最右端 确定分子量二 碎片离子 含奇数e 或 含偶数e 电荷标在上方 不确定时 或 2 3质谱中的裂解类型 阳离子的裂解类型1 单纯开裂 均裂 若R1 R2 异裂 半异裂 最易失电子的是杂原子n电子 电子 电子 C C C H 失电子能力 质谱中的裂解类型 2重排开裂 重排离子更稳定 麦氏重排 有不饱和中心C X X O N S C 有 氢 能转移到X原子上 脱掉一个中性分子 3核磁共振 最早美国两所大学1945年同时发现NMR哈佛的Purcell和Pound发现石腊质子有NMR现象斯坦福大学的Bloch和Honson发现H2O中质子有NMRPurcell和Bloch因此而获得诺贝尔奖 1953年第一台仪器商品化 当时仅30MHZ至今50多年中 这门学科共12位科学家获诺贝尔奖 核磁共振波谱的产生 磁铁 提供稳定的高强度磁场H扫场线圈 附加磁场 可调节D接收线圈 产生感应电流R照射线圈 与外磁场H0垂直 有60兆 90兆 兆数越高 图谱越精密 注 三个