Western Blot常见问题及处理.doc

Western Blot常见问题及处理Western印迹要想做的好，每个步骤都不能马虎，细节决定成败！做的过程中自己要多总结，用心去体会，失败不可怕，可怕的是不去总结经验和教训，成功都是从不断的失败中得来的。注意事项：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.加水液封时用100ul的枪,缓慢均匀的加,以免产生胶不均匀.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气泡和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min).加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对pvdf膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.否则一旦弄错先后顺序会很麻烦的。转膜前1-2个小时-20预冷转膜液，特别是新鲜配的转膜液。预冷后转膜效果较好。转膜液可以重复利用，每次用的时候再加点甲醇就可以了。转膜时，一定要将三明治各层之间的气泡赶干净，否则转膜时产热量会很大，很影响转膜效率。离心管装满水放-20冻好，放在转膜液中降温。转膜完，可以通过预染marker看看转膜的情况。有没有转过了穿到膜后的滤纸上，或者还有部分残留在胶上。以便下次调整转膜时间和电压。二抗浓度不宜太高否则会导致背景过高.常见问题：1电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。 条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾原因：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散原因：加样量过多。2. 抗体孵育时用什么容器：我们用过PE手套加封口机，用过盖玻片盒子的盖子，最近在淘宝上看到一个抗体孵育盒，还蛮好用的，推荐。3Western blot结果中背景较高可能的原因及建议：膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高建议4结合过夜。选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。检测时曝光时间过长减少曝光时间。4Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。上样量过高，太敏感适当减少上样量。一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。一抗不纯纯化抗体一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。5. Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。一抗孵育时间不足建议4结合过夜。二抗与一抗不匹配选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。6. 其它现象：膜上多处出现黑点或黑