EM菌分类组成及培养技术.doc

EM菌分类组成及培养技术一.EM菌分类组成1.培养基1.1分离培养基： 1.1.1肉膏蛋白胨培养基(培养细菌)牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L， pH7.2-7.4， 1.1.2改良PDA培养基或麦芽汁培养基 （酵母菌）20马铃薯汁1L 葡萄糖20g/L KH2PO43.0g/L MgSO4 1.5g/L VB1 8mg（半片） 琼脂15-20g/L 自然pH1.1.3乳酸菌培养基（培养乳酸菌）1.1.3.1番茄汁培养基：牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖10g/L，番茄汁200 g/L，吐温-80 0.05%，碳酸钙15-20g/L，溴甲酚绿0.01%，琼脂15-20g/L， 番茄汁的制作：将新鲜番茄洗净，切碎(切勿捣碎)，放入三角烧瓶，置4冰箱8-12h，取出后用纱布过滤即成。如一次使用不完，可将其置入0冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。 pH6.51.1.3.2MRS培养基 （分离培养计数用）蛋白胨10g/L牛肉膏10g/L 酵母膏5g/L 柠檬酸氢二铵2g/L 葡萄糖20g/L吐温80 1.0mL/L、乙酸钠5g/L 磷酸氢二钾2g/L 硫酸镁0.58g/L 硫酸锰0.25g/L 琼脂15g/L pH 6.5。（分离培养基），当MRS培养基冷却至45-50时,加入已灭菌的碳酸钙充分混匀,倒平板。1.1.4光合细菌培养基 (培养光合细菌）1.1.4.1酵母膏 1.0 g/L 羟基丁二酸（苹果酸）0.5 g/L NH4C11.0g/L NaAC 3.0 g/L NaC11.0g/L NaHCO3 1.5g/L K2HPO4 0.2g/L MgSO4 0.2g/L PH 7.0-7.2 （富集用） 1.3.2酵母膏3.0g/L，蛋白胨3.0g/L 氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.5 g/L，琼脂8g/L，生长因子5mL /L， pH6.8-7.0生长因子：维生素B1 0.001mg，尼克丁酸 0.1mg，对氨基苯甲酸 0.1mg，生物素 0.001mg，以上药品溶于蒸馏水中，定容至 10mL，然后过滤除菌。1.1.4.2RCVBN:酵母膏0.1g/L蛋白胨0.01g/L NaAC 2.0g/L 丙酸钠0.3g/L NaC1 0.5g/L NH4C11.0g/L MgSO4 0.2g/L 谷氨酸0.2mg K2HPO4 0.3g/L KH2PO4 0.5g/L CaC12 0.05g/L MnC12 0.003g/L FeSO4 0.005g/L （选择分离培养基） PH6.8-7.0 1.1.5马丁培养基（培养丝状菌） 葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，三水合磷酸二氢钾1g/L，水合硫酸镁 0.5g/L，孟加拉红（1mg/mL）3.3mL，琼脂15-20g pH自然，加入2%去氧胆酸钠溶液20mL，链霉素溶液10000u/mL0.33mL。或用虎红培养基，涂平板或划线时琼脂增加5g/L。 1.1.6高氏合成一号培养基（培养放线菌） 可溶性淀粉20g/L，硝酸钾1g/L，三水合磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠0.5g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，琼脂15-20g/L，抑制剂重铬酸钾50-70mg/L即重铬酸钾3% 3.3mL/L，100ml培养基加入1ml0.1的FeSO4溶液。 （分离计数保存用） pH7.2-7.4 黄豆粉25g/L 牛肉膏5g/L葡萄糖15g/L 碳酸钙1.0g/L 磷酸氢二钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 海盐10-15g/L （种子培养基） pH6.8-7.0 1.1.7乙醇培养基（培养乙酸菌）乙醇20mL/L，乙酸钠5g/L，酵母膏1g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙10-15g/L，琼脂15-20g/L pH7.01.2.发酵培养基：1.2.1葡萄糖10g/L 酵母膏10g/L 蛋白胨 6g/L NaC1 10g/L MgSO4 0.2g/LKH2PO4 0.5g/L K2HPO4 0.3g/L PH6.5一6.81.2.2葡萄糖10g/L 可溶性淀粉5g/L K2HPO4 1g/L MgSO4 0.5g/L KNO3 1g/LFeSO4 0.01g/L CaC12 0.01g/L PH6.5-6.81.2.3糖蜜 5-10% 酵母提取物 0.3% 尿素 0.3-0.4% K2HPO4 0.1-0.2% 海盐0.3- 0.5% VC 0.01-0.03% PH自然 1.2.4糖蜜5-8% 酵母提取液2% 豆芽汁5% 西红柿汁3-5% PH 7.01.2.5葡萄糖 15-25g/L 尿素 0.4-0.8% 玉米浆15-25g/L 蛋白胨 15-25g/L酵母膏15-25g/L MnSO4 0.02-0.05g/L vB vc 1.0g/L PH6.8-7.02.菌种分离纯化培养： 2.1.样品来源：EM6 利菌多2.2.菌种分离：将试样菌液稀释至10-2 ，采取稀释平板法进行分离。稀释平板法操作要求：方法1：取无菌平板3-5个倒平板（培养基温度不宜过高过低），空培12-24h，用无菌吸管吸取约0.1ml10-2稀释菌液于平板1涂布，其他平板分别0.1ml无菌水，依次涂布，经培养后各平板出现不同数量的单菌落。方法2：取3-5个空平板，平板1加入10-2稀释菌液约1ml，其余平板加1ml无菌水或生理盐水，然后用无菌接种环从平板1蘸取两环依次涂抹几次，立即倒入45-50培养基混均后倒置培养。细菌总数、醋酸菌、酵母菌和放线菌采用方法1，乳酸菌和光合细菌（暂时不做）方法1双琼脂平板法，丝状真菌方法2（减少菌落扩散）。菌落挑选：选择涂布或混菌平板上的30-50个单菌落的进行识别，太少会容易漏选，太多不易识别或相互接连。2.3菌种纯化：采用划线分离法菌株进行纯化培养1-3次，至纯培养物。对于分离后单菌落识别不清的，可在相同培养基上划线培养后进行菌落形态比较区别，然后接种于斜面低温保存备用。兼于微生物对培养基的选择性，乳酸菌群在番茄汁培养基和MRS培养基培养，酵母菌在PDA培养基和虎红培养基培养，尽量选择多的不同单菌落，然后在相同培养基上进行纯化培养后对菌落识别。 2.4.菌种鉴定：生理生化鉴定（菌落特征 形态特征 生理生化特征）和分子学鉴定二.EM菌发酵工艺技术1.菌种来源：乳酸菌群：EM6利菌多分离筛选菌株2-3株酵母菌群：上述产品纯化筛选菌株2株，热带假酵母1株（广东微生物所）芽孢杆菌群：南海所产品分离纯化菌株1株，三环肥水产品分离种1株放线菌群：弗氏链霉菌1株（广东微生物所）丝状真菌：黑曲霉1株，米曲霉1株（广东微生物所）光合细菌群：德国沼泽红假单胞菌1株，上海水大沼泽红假单胞菌1株（中国农科院资划所）2.菌种的制备：2.1工艺流程：斜面三角瓶或茄型瓶血清瓶种子罐（糖蜜灭菌罐）2.2菌种制作：2.2.1菌种活化：保存时间较短的斜面，可直接用于生产，甘油管、石蜡管和冻干管需活化后使用，冻干管每支接两支斜面。斜面保种试管15x150mm或18x180mm（8-9ml），生产斜面25x200mm（20-25ml），200-250ml茄型瓶（45-50ml）。2.2.2菌悬液的制备：每支斜面分别加入5-10ml无菌水或生理盐水，用接种环刮洗菌苔制成菌悬液备用。2.2.3三角瓶或茄型瓶培养接种前灼烧管口迅速一对一加入三角瓶中，茄型瓶（45-50ml/200-250ml即体积的20），用无菌吸管加入2-3ml菌悬液，作水平晃动，使菌液均匀布满整个琼脂表面，使用时加入30ml无菌水进行刮洗制成菌悬液，每瓶相当于150ml液体菌种。2.2.4血清瓶培养：培养基、装料量及培养条件，根据菌种的生理特性确定。2.2.5种子罐培养培养基以较高碳氮比配料，装料量70-80，采用常压间歇灭菌（两次间隔24h）。2.3制种实例：2.3.1斜面菌种：酵母菌株：2-3株 乳酸菌株2-3株 芽孢杆菌2株 放线菌1株 丝状真菌2株 光合细菌2株，分别制成菌悬液备用。2.3.2三角瓶或茄型瓶培养芽孢杆菌、丝状真菌和放线菌采用茄型瓶培养，每株制作两瓶。乳酸菌和酵母菌液体摇瓶培养，每瓶接一支斜面不同菌种菌悬液，在适宜条件下培养。培养温度：酵母菌 丝状真菌和放线菌25-28 乳酸菌和芽孢杆菌30-37.培养时间：乳酸菌和酵母菌2-3d，丝状真菌5-7d，放线菌7-10d 芽孢杆菌1-2 d。注：液体培养丝状真菌2-3d，放线菌（种子转接2-3d）6d，芽孢杆菌18-20 h.乳酸菌液培养液使用量850ml/L三角瓶，酵母菌液体摇瓶培养350ml/L三角瓶。2.3.3血清瓶培养：酵母菌培养液6.5L/10L 25-28 120r/min 48h,乳酸菌培养液19L/2x10L 30-35静置2-3d，芽孢杆菌培养液4.5L/10L 30-35 180-200r/min 18-22h，放线菌培养液4.5L/10L 25-28 120-140r/min 48-72h，丝状真菌培养液4.5L/10L 25-28 120r/min 48-72h。2.3.4常压种子罐培养装料量800L/1200L种子罐（常压），常压间歇灭菌：灭菌温度100 60-90 min，间隔12-24h，再次灭菌（100）60min，通冷却水降温至温度30-35接种培养，8-10h，间歇搅拌两至三次，12h后静止培养，培养时间：室温30-35 5-7d，25-30 8-10d 20以下10-14d，PH4.0-5.0.活菌数在8-10亿cfu/ml。2.3.5菌种分装：用3双氧水对5L塑料桶冲洗灭菌后分装，菌液要满桶密闭。3.EM菌扩大培养：3.1种子罐扩培：3.1.1捅体灭菌（1000L）将捅体内外清洗干净，然后注满自来水，并加入250-300ml 10次氯酸（钠），搅拌均匀，静止12-24h后泵入其他种子罐中，连续循环使用。捅体内外用滤菌水冲洗两遍及时使用。留种培养时罐体不作清洗灭菌，培养液使用后要对罐体实施灭菌操作程序进行。3.1.2培养基配制培养基：糖蜜100kg 酵母膏1.25kg（0.75kg追加） 尿素0.70kg KH2PO4 0.5kg 无机复合盐0.25kg。 种子培养基和发酵培养基同时进行常压灭菌，95-100 2-3h。要防治出现灭菌过程中液体外溢现象。营养成分添加：糖蜜10%（100kg）、酵母提取物、尿素、磷酸二氢钾、少量矿微元素等。发酵培养基进罐后预留培养液作为种子培养液，追加酵母提取物（0.75kg），根据培养液PH大小酌情用盐酸调节PH至5.0-5.5，菌液留加时不调整。接种量：5.5-8.0即55-80kg。3.1.3培养条件： 温度 时间d 15-20 12-1520-30 8-10 30-35 6-7 35-38 4-5注：微氧或厌氧培养。3.2发酵罐扩培（8000L）3.2.1培养基：糖蜜10%（800kg）酵母膏4.0kg 尿素5.6kg KH2PO4 0.5kg 复合盐2.0kg。 3.2.2罐体灭菌消毒：生产完毕后应及时清洗消毒罐体，防止残留滋生杂菌，打开罐体底部排液阀，用滤菌水将罐体冲刷两遍，必要时带用清洗工具，并关闭排水阀，将次氯酸钠溶液适度稀释对罐内泼洒，消毒灭菌30-45min.打开罐底排液阀，用滤菌水冲洗两遍，水排完后关闭阀门。2.2.3发酵条件:温度 时间d 30-35 25-30 20-30 30-35 15-20 35-45 3.2.4放罐指标： 菌液PH3.0-4.0，活菌数大于6-10x108cfu/mL。菌液产气小，呈棕红色半透明液体。较浓酸甜味或酸味，气味纯正，酸味适中，无臭味。3.2.5观察与处理：发酵二至三天液体起泡沫，七至八天泡沫消失，液面浮一片悬浮物，十三天左右悬浮物沉入底部发酵基本完成。一般培养温度高悬浮物多些。颜色由淡黄色变成半透明棕黄（红）色（菌液呈乳白色视为发酵失败）。发酵菌液气味呈酸带甜香.尝之略涩。酸味过小，系发酵时间短.营养少.温度低所致。液面少许浮物属正常，少量臭味视为培养时间短.染菌所致,应适当放气。3.2.6菌种复配：光合细菌在灌装前加入，打入量为1.5-2.0，即每罐120-160L，作为水产有效微生物的补充。附：1.水质改良有效微生物（EM）二步连续发酵工艺（专利）在同一容器先后进行好氧和厌氧连续发酵。好氧特征是高含氧 高PH和低碳源，厌氧特征是高碳源 低PH和缺氧。该工艺的优点：菌种搭配平衡，乳酸菌 酵母菌芽孢杆菌分别达到106 cfu/mL，总活菌数达到107 cfu/mL以上，产品中所有细菌处于抑制状态，保质期长达六个月以上，没有胀气现象。 工艺操作：发酵容器 1000-3000升塑料桶或不锈钢桶，底部布满气管，气泵供气（过滤空气）液体轻微流转，装液量80%发酵容器。发酵容器及器具采用化学灭菌法，培养基高压灭菌滤菌水补齐。发酵过程：（1T计）低浓度双糖培养基：红糖0.2-0.4% 蛋白胨0.05-0.10% KH2PO4 0.10% MgSO4 0.01% KC1 0.05% NaC1 0.05% 维生素 矿物元素 氨基酸预混料10g/T PH7.2-7.5.接入1L（0.1%）芽孢杆菌 酵母菌 乳酸菌的混合液，在25-35有氧条件下发酵2-3天，当培养液PH6.0-6.5，光密度（600）达到1.5，芽孢杆菌和酵母菌数量均达到106 cfu/mL时进入高糖发酵。红糖0.5-0.7% 糖蜜0.1-0.2% 静止发酵3-5天 。培养液PH3.5-4.0 光密度（600）达到1.8，芽孢杆菌 酵母菌 乳酸菌数量均达到106 cfu/mL ，总活菌数达到107 cfu/mL以上，即可放罐灌装，密封保存，保质期六个月。2.有效微生物（EM）制剂制备（专利）由光合细菌 酵母菌 放线菌 乳酸菌 芽孢杆菌等10属80多种组成，有的加入双歧菌群，用于农业还加入固氮菌群。制作过程：（1T计）红糖25-40kg 搅拌均匀加入光合细菌 放线菌 酵母菌各5L，各类活菌数不低于108 cfu/mL，搅拌发酵24-36h。加入乳酸菌 芽孢杆菌 双歧菌群各5L，各类活菌数不低108 cfu/mL，继续搅拌发酵24-36h。 总接种量3%左右，搅拌时间2-3天，发酵温度25-35。然后转入静止发酵10-15天。放罐指标：PH3.5-4.0 呈棕红色半透明状液体，