固相萃取与超高效液相色谱联用测定沼液中的四种植物激素.doc

固相萃取与UPLC联用测定沼液中的四种植物激素 文先红1 宋成芳2 张妙仙2 单胜道 21（浙江农林大学理学院，临安 311300） 2（浙江农林大学环境科技学院，临安 311300）摘要：沼液中含有丰富的有机酸，植物激素等有机质，因而被广泛用作植物生长促进剂。本实验建立了一套可靠的在沼液中提取，纯化和测定四种重要的植物激素(GA3,IAA,ABA and ZT)的方法。经过液液萃取后，通过SPE固相萃取纯化和浓缩样品, 进入ACQUITY UPLC BEH C18 colum (2.1mm x 50mm ,1.7m )进行色谱分离, 流动相采用甲醇和0.1%的甲酸水溶液（pH=3.2），流速0.22ml/min, 进行梯度洗脱，PDA检测。实验中对影响色谱分离的几种重要因素进行了讨论，样品中四种激素的回收率可达91.3% 到 101.2%，结果证明SPE-UPLC方法能对沼液中的四种激素进行高效率的分离，测定。关键词： 沼液，激素，超高液相色谱，固相萃取1 引言沼液是沼气厌氧发酵后的产物, 含有丰富的氮、磷、钾等营养元素，还含有蛋白质，有机酸和多种植物激素，其速效营养能力强, 成分可利用率高, 而且具有防病抗逆作用, 是一种优质的具有生物肥料和生物农药双重功效液体肥料，特别其提取物可用作促进植物花果生长的叶面肥。植物激素中的细胞分裂素(ZT)能促进细胞分裂, 对种子和芽有促使萌发的作用, 含有的3-吲哚乙酸(IAA)能促进种子发芽, 提高发芽率，赤霉素(GA)可以刺激农作物茎、叶快速生长, 而脱落酸(ABA)则具有抑制生长、促进衰老的作用。因而作为叶面肥使用的沼液必须测定其中这四种重要的植物激素含量。近几十年来, GC 法,GC-MS法及电分析法, 液相色谱法(HPLC)，液质连用(LC-MS)等被广泛地应用于植物激素的分离和定量测定。其中高效液相色谱是植物内源激素分析的有效手段, 但在同时测定植物组织提取液中的多种内源激素时, 经常出现到分离度差、存在干扰峰及严重拖尾现象。超高效液相色谱采用1. 7 m颗粒度的色谱柱填料 ,能获得更高的柱效 ,并且在更宽的线性范围内保持柱效恒定; 超高效液相色谱的峰容量、分析效率、灵敏度较常规高效液相色谱有了很大的提高。在提取方法上，与液液萃取法相比, 固相萃取对分析物有更高回收率;更有效地将分析物与干扰物质分离。本研究旨在建立对沼液中植物内源激素的有效提取方法, 并探讨利用UPLC法同时测定玉米素 ZT 、赤霉素 GA3、3-吲哚乙酸 IAA 和脱落酸 ABA四种激素的色谱分析条件。2. 实验部分 2.1 仪器与试剂 ACQUITY Ultra Performance LC 超高效液相色谱仪Waters公司，Sep - Pak C18 （500 mg, 3 mL, Waters公司），标样ZT ，GA ，IAA，ABA为 SIGMA 公司产品; 甲醇、三乙胺、甲酸纯度为色谱纯(德国 Sigma-Aldrich公司), 盐酸, 乙酸乙酯, 石油醚为分析纯。分别称取标准品各 10. 00mg, 用甲醇溶解后转移至 10mL棕色容量瓶中, 用甲醇定容 ,于 4 条件下保存。根据需要, 用甲醇稀释上述标准储备溶液 , 配制成不同浓度的标准工作液。2. 2色谱条件色谱条件: BEH C18 柱（2.1mm x 50mm ，1.7m）; 流动相为A为甲酸水溶液（w/v,0.1%, 甲酸先用三乙胺（TEA）调节pH=3.2.）, B为甲醇, 流速0.22ml/min。流动相梯度设置: 03 min, 90% A; 36 min, 9070% A; 610 min, 70% A; 1016 min, 70% 55% A; 1618min, 55% A;1818.1min, 5% A; 18.120.1 min, 5% A; 20.2min, 90% A。检测: DAD，200-450nm 。进样量: 10 L; 柱温: 25 。2.3 样品前处理从沼液池中取出的液体过滤浓缩20倍得到沼液50ml, 加入50 mL 80% 冷甲醇，4 冷浸提取24 h ; 于4 5 000 r/ min 离心10 min , 重复3 次, 残渣用少许80 %甲醇洗3 次, 合并全部洗涤液和浸提液, 用等体积石油醚萃取脱色3次, 其水相用1 mol/ L 盐酸调pH至2. 5 , 用等体积乙酸乙酯萃取3 次, 弃去水相; 合并乙酸乙酯相在于3540 下减压蒸发至10ml后， 用真空干燥箱干燥, 再用10ml 10%的甲醇溶解，再过Sep - Pak C18小柱（放入样品前，先用5ml的methano净化，再用5ml去离子水活化, 放入试液后, 用去离子水5ml先淋洗，再用5ml 80%的甲醇洗脱） 收集后, 再经超滤膜过滤, 作为供试液。3. 结果与讨论 3.1 pH对沼液中激素提取效果的影响 由于植物内源激素本身是偏酸性的物质，为了得到最大乙酸乙酯萃取效率，实验了不同的酸性pH=2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5对萃取的影响，实验过程中萃取时间为30min，室温250c遮光进行以防止吲哚乙酸的分解。结果显示酸性越强萃取效果越好，故实验中用盐酸把pH调节到2.5进行萃取。3.2 色谱条件的优化选择 实验采用甲醇和甲酸水溶液作为流动相，由于这几种植物内源激素偏弱酸性，重点考察了pH的变化对分离效果的影响。当pH在3.2, 3.4, 3.8, 4.2, 4.6 之间变化时，发现pH高于3.2时随着pH 的增大组分的保留时间变长，且峰形变钝有拖尾现象，在酸性较高时峰形有明显改善，减少了拖尾程度，可能由于抑制了其它杂质离子与组分之间的竞争平衡及一些不可逆化学吸附从而使峰的形状得到了改善，最后采用pH 为3.2。相对于固定洗脱，采用梯度洗脱法能延缓出峰时间以避开部分杂质峰干扰, 从而达到较好的分离效果，特别是其中赤霉素GA与吲哚乙酸IAA组分的保留特性相似，容易发生峰的干扰，采用上述梯度洗脱程序可在15min之内将这些组分完全分离，不仅可以大大加快分析速度而且峰形也好，定量分析结果准确。在流速的选择上，当速度增加时，扩散加剧，组分保留时间缩短，但峰重叠程度增加，GA与IAA之间的出现部分重叠拖尾现象，考虑到实际样品含有有机物成分多，为防止重叠故实验选择较低流速0.22ml/min。有机酸在水溶液中存在离解平衡，温度升高时会增加溶质的离解, 离子受 DONNAN作用, 虽然保留时间减少, 但不利于有机酸的分离 ; 激素中GA, ABA, IAA都含有羧酸基团，当温度超过 25时各有机酸分离效果较差。因此, 本实验选择柱温 25。3. 3 方法线性范围、检出限、精密度将ZT ，GA ，IAA，ABA等四种激素标准样品储备液按一定比例稀释, 用优化后的色谱方法进行分析测定, 得到相应的峰面积 , 进行线性回归处理。它们的峰面积和质量浓度 mg/L 的相关系数都在 0. 99910. 9997之间,说明在设定的浓度范围内线性关系良好; 样品平行测定 5次,考察方法精密度; 通过分析稀释后的标准品储备液, 以 3倍信噪比 S /N 计算检出限。色谱图和结果见图1和表 1。图1. 标样的色谱图(四个色谱峰从左到右分别对应的激素是ZT,GA, IAA, ABA)。表 1 回归分析、精密度、检出限Table 1Regression analysis, RSD and detection limit激素 线性范围 回归方程 相关系数 精密度 检出限 Phytohormones Linear range Regression equations Correlation Precision Detection limit (mg/L) coefficien RSD (%) (g/l) Zt 0.1100 Y = 6E+10X- 271024 0.9997 0.53 1.5 GA 0.2 100 Y = 5E+09X 84718 0.9991 0.71 5.9IAA 0.1100 Y= 5E+10X 542536 0.9993 0.57 2.2ABA 0.1100 Y = 4E+10X 251293 0.9996 0.32 1.13.4 沼液中激素的色谱分析 用上述实验方法提取, 分离处理得到的沼液进行UPLC测定，图1和图2显示了标准品和样品的色谱图，从图中可以看出，在标样的保留时间14.18min对应的ABA在样品中没有发现，而在8.01min对应的峰很高，通过回归方程计算并除以提取过程中的浓缩倍数得到GA含量为6.02g/ml, 而5.43min对应的Zt含量为0.25g/ml, 8.9min对应的IAA含量为0.34g/ml. 实验表明含量最高的是赤霉素GA, 而抑制生长、促进衰老的作用的脱落酸ABA基本不含有。在沼液中加入4种激素的标样，其加标回收率为91.3% 101.2%，见表2。图2. 沼液提取物的色谱图.表2. 样品测定结果及回收率激素 含量(g/ml) 加入量 (g/ml) 测得量 回收率 ZT 0.25 0.21 0.42 91.3%GA 5.02 3.00 8.12 101.2%IAA 0.34 0.32 0.62 93.9%ABA - 0.35 0.33 94.3% 上述结果表明, 本实验方法具有处理简单、分离度好、分析速度快等优点, 适用于沼液中的四种主要植物激素的同时快速检测。 Simultaneous determination of four phytohormones in Biogas slurry by solid-phase extraction and UPLCBiogas slurry, which contain rich organic matter, such as organic acid and some phytohormones, is extensively used as a growth promoting supplement for plant . In this paper, an reliable method of extraction, purification and determination to four phytohormones (GA3,IAA,ABA and ZT ) in biogas slurry has been developed. Accompanied with liquid phase extraction, the solid- phase extraction technology was applied to concentrate and purify the the biogas slurry, the separation was carried out on a ACQUITY UPLC BEH C18 colum (2.1mm x 50mm ,1.7m ) using gradient elution with methanol/water containing 0.1% Formic acid (pH=3.2) as the mobile phase at the flow-rate of 0.22mL/min, and PDA detection. The effects of several UPLC parameters on the resolution were studied systematically. Good recoveries from 91.3% t o 101.2% for the four phytohormones were o