小鼠肝移植.doc

二袖套法制作小鼠原位肝移植模型的技术要点目前，肝移植被认为是治疗终末期肝病的有效手段，并在全世界广泛开展。但肝移植的开展仍然面临着各种各样的问题，如缺血再灌注损伤、脏器保护的防放和术后面临的排斥反应等。因此，建立稳定的肝移植动物模型以进行相关研究，具有机器重要的临床意义。自1991年Qian等首次建立非动脉化的小鼠原位肝移植模型以来，该模型已经成为研究肝移植术后免疫学的主要动物模型，有进一步的研究发现，动脉化的小鼠肝移植模型术后肝功能恢复的更好，更接近生理指标， 二套袖法合并肝动脉重建的肝移植模型特点在于除了肝上下腔静脉仍用缝合法外，门静脉和肝下下腔静脉应用套袖吻合，胆道及肝动脉用插管法完成吻合笔者在德国海德堡大学及美国 中心从事肝移植研究6年余，目前已经已经成功的建立了超过2000例小鼠原位肝移植模型，成功率达到98%以上。现将笔者的一些体会总结如下。一、 术前的一些注意事项首先根据小鼠的大小选用合适的袖套管。如果袖套管太大，静脉壁很难向外翻；如果袖套管太小，静脉外翻虽然很容易，但是术后很容易形成动脉栓塞，导致受体死亡。笔者的经验是选取23-28g的小鼠，所用袖套直径为2.1mm左右。另外，在前期制作套袖管时必须注意以下几个方面：袖套管不要太长，Kamada提出是2mm左右，但笔者认为1.5mm更佳，因为如果袖套管过长，所需的静脉长度就要增加，这回增加手术难度；袖套管的外表面可以打磨或刻小赤，以增加外表面的摩擦力，这对外翻静脉有很大的帮助；由于胆道及肝动脉的插管，要一队尖锐，一端平钝，使用时，钝端插入供体侧，尖锐端插入受体侧，这样可降低手术难度，且不会损伤供肝；所用的操作都不允许用手直接接触肝脏。二、 供体手术小鼠麻醉成功后，固定在手术台上，腹部剃毛，取腹部正中十字切口入腹。先用阑尾钳将剑突提起，暴露上腹部，将小肠推向左侧，以显露肝门及下腔静脉。将肝脏与周围的组织游离。将直径0.61mm的导管插入胆总管，并用8-0丝线固定，以备之后与受者的胆总管吻合。游离肝动脉，经门静脉以4灌注液灌洗肝脏，同时由右肾静脉水平以下的下腔静脉放血。灌洗完毕后，肝脏呈黄色。离断肝上下腔静脉，肝下下腔静脉、门静脉及肝动脉，此时肝脏已完全游离，将肝脏置于冷保存液中。整个过程要求在12min以内完成。笔者一般在游离肝脏前先由下腔静脉给予肝素钠注射液，这是因为在游离肝脏的过程中不可避免的会翻动肝脏，局部会形成微血栓，影响术后肝脏功能，导致小鼠死亡。先给予肝素钠注射液可以减少微小血栓的形成，只要在游离肝脏过程中操作仔细，并不会造成太多出血。供肝一定要冲洗干净：在食管与肝脏之间有一支交通血管，有些个体该血管很粗，应妥善结扎，防止供肝冲洗不净或恢复血流时出血；左膈静脉及右肾上静脉也应结扎牢靠，不然回导致供肝冲洗不净，直接影响供肝质量；在经门静脉罐洗时，一定注意不要有空气进入门静脉，否则肝脏难以灌洗干净；在灌洗过程中一定要慢，压力不能过高，否则会损伤肝脏；另外，灌洗过程中可以轻轻调整灌洗的方向，以达到最佳灌洗效果。肝下下腔静脉在右肾静脉水平应切断，应尽量远离肝脏切断门静脉，以方便下一步的操作。肝上下腔静脉不可保留过长，否则术后因为呼吸的上下波动，易造成肝脏流出道不畅，引起肝淤血，造成小鼠死亡。一般以膈肌水平为佳。如果时间紧迫，可以连同膈肌一起剪下，后期再修整。另外，在游离肝脏时，尽量不要直接按压肝脏，引尽可能用旋转的力度轻轻拨动肝脏，以避免造成肝脏损伤。三、 供肝修整将供肝浸泡在0-4的保存液中进行修整。将门静脉有袖套管腔内穿出，用钳子夹住袖套柄以固定整个袖套。将门静脉壁外翻包绕袖套管，然后用8-0丝线固定。钳子不要夹门静脉壁。同样方法完成肝下下腔静脉袖套管的套入。将大小合适的导管插入肝动脉，并用8-0丝线固定。再次以2ml灌注液经门静脉和肝下下腔静脉灌注肝脏。一般首先修剪肝上下腔静脉，长度以达膈肌平面为佳。如果实在有困难，也应尽可能保留肝上下腔静脉前壁的长度，以方便后期吻合，而后壁稍短一些对后期温和影响不大。将肝下下腔静脉及门静脉周围的脂肪和纤维组织清楚干净，以方便套入袖套管。再翻转血管时，要注意调整血管方向，以将血管腔最大程度打开，防止血管扭曲。这点很重要，否则术后易发生血栓形成，影响存活率。修整完毕后，一定要再次冲洗肝脏。关于保存液，如果使用的是UW液，则肝脏可冷保存48-72h；如果使用HTK液，肝脏可保存12-24 h;如果采用林格液，肝脏最多可保持4-6h。四、 受体手术经腹部正中切口进腹，用拉钩暴露肝脏。肝脏的游离同供者手术。所需离断的血管及胆道均应靠近肝脏切断，以保留足够长度。用无损伤钳连同膈肌一起夹闭肝上下腔静脉。需特别强调的是，右肾上腺静脉一定要结扎牢靠，否则术后出血不止，导致动物死亡。受体不要给肝素钠注射液，否则术后会出现难以控制的渗血。再次经门静脉和肝下下腔静脉灌洗供肝后，将其置入肝窝中。首先用10-0prolene线端端温和（连续缝合）肝上下腔静脉。之后吻合门静脉和肝下下腔静脉，即将袖套插入受者相对应的静脉，用8-0丝线固定。完成肝上下腔静脉、门静脉和肝下下腔静脉的吻合后，恢复肝脏的血液灌注，肝脏颜色很快变红。胆管和肝动脉的温和也用插管完成。1.首先无肝期时间不要超过20min。一般而言，20min以内小鼠基本可以存活；20-25min要靠一些非人为因素的影响；超过26min，小鼠基本上没有存活的可能。2.吻合肝上下腔静脉要小心，太紧或太松都会造成小鼠死亡。笔者建议采用双线吻合法，以便防止上述问题的发生。同时在完成肝上下腔静脉吻合前，尽量排尽空气。3.肝下下腔静脉在套入袖套管之前要防除少许血，以排出血栓。门静脉要求不是很严格。4.供肝在从冷藏池拿出后，要用常温的液体冲洗肝脏，而不是4的液体。已有研究表明，常温液体冲洗有助于提高术后动物的村活率。5.在吻合肝动脉时，如果比较困难，可以切断大鼠的胰十二指肠动脉，将陶管直接插入腹腔动脉干内，这不会影响小黍的生存。6.小鼠没有肝动脉仍然可以长期存活，但肝脏功能指标会稍差一些，因此最好吻合肝动脉。7吻合肝动脉及胆总管时，受体的肝动脉和胆总管要剥离干净，以免在插管过程中形成夹层，增加难度。8.应在完成肝上下腔静脉、门静脉和肝下下腔静脉的吻合后再恢复肝脏血液灌注，否则易造成空气栓塞。9 门静脉开放以后，如果肝上下腔静脉少许出血，切忌大力牵拉肝脏，以免造成不可挽救的大出血。可以轻轻暴露视野，加补一针或用纱布局部压迫止血。五、术后处理术后要将肝脏各叶调至自然位置，不要有扭曲；要给小鼠恢复体温，体温上升要均匀，不要局部过快；术后不用给予抗生素及抗排斥药物，小鼠可以存活超过两年；术后可以经尾静脉、腹腔或皮下适当给予少许液体。若术后小鼠马上死