在長期污染土中篩選好氧性五氯酚降解菌.doc

2008屏東科技大學暨北京科技大學第三屆學術交流研討會 北京科技大學 中國、北京2008年10月1819日 論文編號：CE0819在長期污染土中篩選好氧性五氯酚降解菌邱瑞宇1、邱春惠1、賴東璟2、李冠慶3、李嘉英3、邱姜縉31屏東科技大學環境工程與科學系副教授2屏東科技大學環境工程與科學系研究生3屏東科技大學環境工程與科學系專題生CE0819-6摘要五氯酚因廣泛的使用及持久性，造成世界各地土壤普遍受到污染。有鑑於生物復育所造成的環境衝擊最小，故本實驗室以長期受高濃度五氯酚污染的土壤加上堆肥，進行分解菌的馴化、篩選與分離。經馴化的培育土中，添加樹皮堆肥的菌群結構分析較不添加堆肥或添加豬糞堆肥複雜、五氯酚降解率也最好，在含200mg/Kg五氯酚濃度土壤中可降解其88%。選出9株可在含100 mg/L五氯酚為唯一碳源固態培養基上生長。大部份菌可耐到400 mg/L的五氯酚濃度，其中兩株更可耐到500 mg/L。再以含100 ppm五氯酚的液態培養基進行降解實驗，以UV或GC進行五氯酚濃度偵測，發現Pseudomonas putida和Kocuria varians可分別降解21 %與60 %五氯酚，將作為五氯酚污染土壤生物復育菌種之參考。關鍵字:五氯酚(Pentachlorophenol)、五氯酚降解菌 (Pentachlorophenol degrading bacterium)、菌 群結構分析(consortium structure analysis)1.前言五氯酚Pentachlorophenol (PCP)為含氯之苯環化合物。氯酚類具有生物抑制性，並且具有穩定性極高的苯環結構，故是一種難分解的有機化合物。在過去十多年被廣泛運用在木材業、石化業、藥業及農業上作為殺菌劑及防腐劑，故現今造成多處土地受到汙染。台灣目前有11處地點受到氯酚化合物的污染10，其污染場址多為工廠、加油站和廢棄場址。故如何有效的處理五氯酚是非常重要的。 許多研究人員利用各種不同方法去除五氯酚，在技術可概分為物理處理，化學處理及生物復育。雖然物化方法可處理大量高濃度的PCP，但卻只是做相的轉移，無法將PCP消失於環境之中。使用生物復育處理PCP不但省成本，最大的好處就是可將PCP完全礦化或轉化成無害的物質如CO2，將PCP對環境的危害降至最低5,6。1951年五氯酚首次被報導可由生物分解9。常見的分解菌有Sphingomonas chlorophenolica、Sphingobium chlorophenolicum、Mycobacterium chlorophenolicus、Mycobacterium fortuitum、Pseudomonas cepacia、Rhodococcus sp.、Corynebacterium sp.及Arthrobacter sp.等1，能有效的將五氯酚礦化，Chandra等人1從高濃度五氯酚紙漿中篩選出的Bacillus cereus和Serratia marcescens經45天後能夠分解50%五氯酚的濃度。Dai4的文章中說明了Sphingobium chlorophenolicum以PCP為碳源時會分泌水合酶(為PcpB基因)、還原酶(為PcpD基因)、脫鹵酶(為PcpC基因)及開環酶(為PcpA基因)等酵素來分解五氯酚的苯環，當分解成只含2個氯的DHCQ時，毒性就降低許多，微生物就比較容易利用，進而達到分解五氯酚的作用。因生物復育關鍵在於需要五氯酚分解菌，本實驗以生物復育方式進行，以長期受高濃度五氯酚污染的土壤，加上樹皮堆肥做為菌群的碳源馴化後，誘發出能降解PCP之菌群，先了解菌群菌相，再篩選出具降解PCP能力強的菌株，供日後製成生物肥料施撒於污染土地。2.材料與方法2.1化學藥品2.1.1碳源碳源為五氯酚Pentachlorophenol (PCP)，純度95 %（東京化成工業，TRADETCIP0033），以乙醇(95%)配製成10000 mg/L儲備溶液，放置陰涼處備用，需要時以濾膜過濾法滅菌。2.1.2無機營養鹽培養液配置成分3，K2HPO4 2.1 g/L、MgSO47H2O 0.2 g/L、KH2PO4 0.4 g/L、CaCl26H2O 0.023 g/L、NH4NO3 0.5 g/L、FeCl36H2O 0.002 g/L。2.2污染土馴化取長期受高濃度五氯酚污染的土壤，添加含五氯酚之營養鹽去馴化，共有三種處理方式，分別為污染土壤（pile）、污染土壤添加樹皮堆肥（pile）及污染土壤添加豬糞堆肥（pile），添加比例為污染土與堆肥比為1：2成為培育土，前90天每週噴灑含50 ppm PCP的無機營養鹽溶液使土壤達到溼潤狀態，後60天只添加營養鹽共馴化150天。(圖1)2.3馴化土的菌群結構取以五氯酚馴化150天後之堆肥土進行微生物基因體去氧核醣核酸萃取實驗，萃取後取得DNA，以聚合酶連鎖反應（PCR）放大此純菌之16S rDNA，進行變性梯度明膠電泳法（DGGE），以了解培育土中菌相2。2.4分離與篩選分解菌由上面馴化過的培育土取6 g，加100 mL磷酸緩衝液放入均質機(Scovill Hamilton Beach)打散1分鐘，取懸浮液0.1 mL和些許沉澱的培育土，以塗抹法塗抹在含50 mg/L PCP無機鹽培養基，置於30培養箱培養，但皆無菌生長。4天後再取培育土5 g加50 mL含50 ppm PCP液態無機營養鹽，在30下150 rpm震盪培養21天後，取少許培養土液塗抹於含50 mg/L PCP無機鹽培養基，置於30培養箱培養。經過7天培養後開始有菌落產生，將有長出菌落的培養基之菌種再以100 mg/L PCP固體培養活化幾次再進行劃線分離，連續分離8次以上以確保菌株為純菌。實驗中分離出9株菌種，暫命為97019709。將分離出的菌種進行50至500 mg/L PCP平板培養基容忍測試，觀察各菌種在不同濃度的生長情形並進行鏡檢，最後保存在含100 mg/L PCP的斜面培養基中，每一個月繼代培養，以確保菌株的活性。2.5液體降解能力測試分離出的9株菌種以液態培養於100 ppm PCP，菌液離心取上層液，以UV分光光度計 (美製，CECIL，CE-3021) 吸光值319 nm檢測PCP濃度變化。或是菌液以二氯甲烷抽取，以GC-FID氣相層析儀(Agilent 6890 GC-FID)檢測PCP濃度變化，攜帶氣體為高純度氮氣。氮氣、氫氣及空氣流速力分別為45、40及450 mL/min，注射口溫度設為200，偵測器溫度設為300，管柱流速1.6 mL/min。升溫條件設定為起始溫度80維持1分鐘，之後以每分鐘20升溫至230，到達230後再以每分鐘30升溫至275，到達275後維持1.5分鐘。3.結果與討論三種馴化堆肥土以1：1加入添加了200mg/Kg五氯酚的無污染土，80天的五氯酚降解情形(圖2)，顯示添加馴化土不論Pile I、Pile II、Pile III，在20天內的降解皆迅速，20天後的降解呈平緩趨勢，未添加馴化土的則和滅菌土一樣沒有降解現象。而添加堆肥的不論是樹皮或豬糞堆肥，相較無添加堆肥的Pile I效果好，顯示堆肥土的添加有助於五氯酚的降解，可能是堆肥改變了五氯酚和土壤之間的吸附結合型態，使得分解效果比沒有添加堆肥的效果好，或是堆肥添加，增加了有機營養源以及菌相複雜度。其中添加樹皮的堆肥土降解率88%最高，因此選擇從樹皮堆肥土篩選分解菌。DGGE分析菌群結構結果顯示，馴化1週的樹皮堆肥土及豬糞堆肥土馴化菌群結構(13、14號）較相似且複雜，而污染土馴化菌群(15號）之菌群結構較為簡單(圖3)，可能是土壤降解實驗中表現出較好降解力的原因。另外馴化6週樹皮堆肥土 (16號) 比馴化1週(13號），菌群結構越趨單純，顯示有優勢菌種。因此取置放長期的馴化土來篩選分解菌。培育土(長期受高濃度五氯酚污染的土壤以1比2加樹皮堆肥)，以含50 ppm PCP的無機營養鹽培養液富育培養，於前期並未培養出任何菌落，但經21天在含PCP營養鹽中馴化後於100 mg/L PCP固體培養基篩選，分離得到純菌9株編為9701、9702、到9709。這經驗說明經PCP馴化過的培育土才能篩出分解菌。篩選出的菌種培養於不同濃度五氯酚培養基進行濃度容忍測試，顯示出這九株菌除了9704在200 mg/L PCP生長明顯受到抑制以外，其他都可以在含400 mg/L PCP培養基下生長，9703及9708其容忍度更高達500 mg/L PCP（表1），比較Chandra等人1由紙漿廢液篩選出的菌株則大多只能耐100ppm，最好的兩株則只能耐300ppm。菌株可以生長在以PCP為唯一碳源的液態培養基中，生長3天達到穩定期。97019709在100 ppm PCP液態培養，以UV分光光度計檢測7天內PCP濃度變化(圖4)，顯示9701及9703從第0天到第7天濃度分別由100ppm明顯下降至88 和73ppm，相較於其他菌株的微量降解，9701和9703在短時間內具有較強的降解能力。另外以GC檢測五氯酚殘留量，由結果顯示9703溶液中PCP濃度由102 ppm下降至65 ppm (圖5)。經生長情況、以分光光度計及GC三者分析PCP濃度變化初步判定9703在短時間內比其他8株菌有較佳的降解能力。而9708在7天時看不出降解能力，因此將9708繼續培養至20天後，發現其降解率高達60 %，推測其原因可能9708較其他菌種生長較為遲緩所導致在7天時看不出任何的降解能力。將9701、9703和9708之純菌，經生理生化(Analytic Products Inc)套組進行鑑定菌種，得知9701和9703為Pseudomonas putida，9708為kocuria varians。這結果與Chandra等人1所做的來相比，同樣實驗時間為7天，但Chandra等人1的菌種可在45天將300ppm五氯酚降解至50%，但其篩選菌生長條件必須添加葡萄糖，以共代謝方式降解PCP，但這需要葡萄糖的菌株在現地復育嚴苛的狀況可能不適用。Saber及Crafold7篩選出的Flavobacterium sp. 可在72小時將100ppm的PCP完全降解。Shah及Thakur8篩選出的Pseudomonas fluorescens可以在120小時將100ppm的PCP完全降解。為了能處理高濃度PCP污染土，如何加強篩選菌株的降解力或使用混合菌群將是未來的方向。4.結論長期受PCP污染土壤，經添加樹皮堆肥馴化後可以降解含100 mg/Kg PCP的土壤中88%的PCP，添加樹皮堆肥的菌群結構也較複雜，可能是降解力好的原因。由其中篩選出可以PCP為唯一碳源的分解菌，其中有兩株五氯酚耐受度高達500 ppm，經鑑定為Pseudomonas putida和 Kocuria varians。在100 ppm五氯酚溶液中降解能力分別為21 %和60%。將可以提供為污染土壤生物復育的降解菌種之一。5.參考文獻1. Chandra, R., G. Anuradha, K. J. Rakesh, and S. Shail, 2006, Isolation and characterization of two potential pentachlorophenol degrading aerobic bacteria from pulp paper effluent sludge. J. Gen. Appl. Microbiol., 52, 125-130.2. Chiu, J. Y., C. H. Chiu, Aerobic PCP Degrading Bacterium from Bark Compost, 2008, The 4th International Symposium of Environmental Biotechnology, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan, p.52.3. Chiu, J. Y., S, Liao, B. Chang, 2003, Bioremediation of Pentachlorophenol Contaminated Soil With Acclimated PCP Degradation Microbial Community , 103rd General Meeting of American Society for Microbiology, Washington, D.C. Q008:515.4. Dai, M.H., and Copley S. D., 2004, Genome Shuffling Improves Degradation of the Anthropogenic Pesticide Pentachlorophenol by Sphingobium chlorophenolicum ATCC 39723. Appl. Environ. Microbiol, p.23912397.5.Hicks, D. M., F. Curtin, and R. Hicks, 1992, In situ bioremediation of soil and groundwater contaminated with petroleum hydrocarbons. Water Environ. Federation, Proceedings of 65th Annual Conference and Exposition, 305-312.6. Pollard, S. J. T., S. E. Hrudey, and P. M. Fedorak, 1994, Bioremediation of petroleum- and creosote- soils: A review of constraints. Waste Management and Research, 12:173-194.7. Saber, D. L., and R. L. Crawford, 1985, Isolation and characterization of Flavobacterium strains that degrade pentachlorophenol. Appl. Environ. Microbiol., 50:1512-1518.8. Shachi, S., and I. S. Thakur, 2002, Enrichment and characterization of a microbial community from tannery effluent for degradation of pentachlorophenol, World Journal of Microbiology & Biotechnology 18: 693-698.9. Watanabe, I, 1973, Isolation of Pentachlorophenol degrading Bacteria from soil. Soil Sci. Plant Nutr,19:109-116.10. 行政院環保署土壤及地下水污染整治網，控制場址查詢 .tw/public/index.asp 於2008/08/28上網查詢。圖1. 污染土馴化系統。污染土或污染土添加樹皮堆肥或豬糞堆肥以1：2成為培育土，前90天每週噴灑含50 ppm PCP的無機營養鹽溶液使土壤達到溼潤狀態，後60天只添加營養鹽共馴化150天。(PileI (u)，PileII (o)，PileIII (p)，未滅菌無污染對照土()，滅菌無污染對照土()圖2 添加馴化土(PileI、PileII、PileIII)與無污染土(五氯酚濃度200g/g)以1：1比例進行五氯酚降解實驗。圖3 各種馴化土菌群結構分析。(13:樹皮堆肥土PileII; 14: 豬糞堆肥土PileIII; 15:污染土PileI(以上為馴化1週); 16:樹皮堆肥土 (馴化6週)表1篩選菌在不同濃度五氯酚培養基生長情況註：每株三重複，(+)全長，(-)皆無生長，(+x)x 表示有生長培養基的數目。7080901001101201301401500123456Time(days)濃度(ppm)97019702970397059706970797089709空白圖4 含100mg/LPCP營養鹽培養液接種篩選菌株以 紫外-可見分光光度計偵測出五氯酚殘留量。0102030405060空白9701970297039705970697079708編號0天7天(ppm)濃度圖5 含100mg/LPCP營養鹽培養液接種篩選菌株以氣相層析儀偵測起始0天和最終7天以氣相層析儀偵測出五氯酚殘留量。Pentachlorophenol degrading bacterium isolation from long term contaminated soilJ. Y. Chiu1, C. H. Chiu1, D. J. Lai1,G. C. Li1, J. Y. Li1, J. J. Chiu11Department of Environmental Science and Engineering National Pingtung University of Science and Technology.Abstract Pentachlorophenol (PCP) is an ubiquitous contaminant in environments. Concerns over its toxicity underline the need to clean up the polluted sites in environments. The bioremediation is recognized as an economical feasible method to remove the pollutant. We acclimated the PCP degradation microbial community by adding PCP into a pile which was composed of a long term contaminated soil mixed without or with one of two different composts (bark or hog-waste) for 150 days of acclimation. The consortium structure analyzed by denature gradient gel electrophoresis showed the bark-compost-soil with more complex structure than those without added compost or added with hog waste compost. It also have highest effective ability to degrade 88 PCP in soil with 200m