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MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。二、几种MTT法实验步骤普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞（细胞浓度的问题见后面的注意事项）接种到96孔板，每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)10ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线药物MTT法实验步骤（1）贴壁细胞：1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的注意事项）。2: 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4: 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。6: 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。（2）悬浮细胞：1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1106/ml（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物10ul；细胞悬液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）2: 置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。三、注意事项：(1) 选择适当得细胞接种浓度和培养时间。 一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以防止细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。因此，很多高手总结出“宁少勿多”的原则，这一原则在大多数情况下是适用的。对于体积大，增殖快的细胞，比如肿瘤细胞，在96孔板中不能接种太多数目的细胞。一般应该少于104个/孔。同时，细胞贴壁后不可培养过久，以防过于密集。大多数肿瘤细胞最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。对于体积小，增殖慢、悬浮的细胞，在96孔板中可以接种更多数目的细胞。甚至可以超过105个/孔。同时，为了观察药物对这类细胞的效果，可以较上一种细胞培养更长时间。在做肿瘤细胞的时候，往往要根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时。(2) 设置调零孔（只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul）。(3) 设置空白孔（细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜）。(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。(5) 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充,因为边缘的32孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大。同时加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中间孔的水分。(6)防止药物与MTT反应。如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。(7) 吸收值分析在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理的空白组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。(8)培养过程中换液100ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持50h以上，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果。如果培养时间长，在48h应该换液一次。(9) 避免血清干扰高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会影响试验的敏感性。因此，一般选小于10胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。(10)判断污染如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大。在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。(11)加DMSO前要把液体小心吸掉但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。对于贴壁细胞，可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸。（一）实验前应明确的问题1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。4.培养时间。200ul的培养液对于104105次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含15胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。（二）实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2.5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1106/ml，按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物10ul；细胞悬液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100?(储存液100 1640）。2）置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。（三）MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60水浴助溶。PBS配方:Nacl 8g，Kcl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调ph 7.4，定容1L。（四）关于细胞的接种(铺板)细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在104/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml100ul/孔=103/孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104. 其它的声音： 1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。2.MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过4000080000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是6000070000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验：1.吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装34ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管，总液量在5ml左右为益3.吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。4.吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打3050次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬于细胞悬液中5s，然后再以一定的速度吸取悬液。）5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。（五）加入MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。如果不使用96孔板，培养基超过100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以过滤的方式灭菌为宜.且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济MTT法介绍又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中 MTT法的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。编辑本段缺点由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。编辑本段MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。编辑本段注意事项MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4