家蚕主要经济性状功能基因组与分子改良研究.doc

项目名称：家蚕主要经济性状功能基因组与分子改良研究首席科学家：夏庆友 西南农业大学起止年限：2005.12至2010.11依托部门：教育部 重庆市科委一、研究内容1 拟解决的关键科学问题 针对丝绸产业质量低、效益差、结构矛盾突出等关键问题，拟在家蚕基因组信息的基础上，以家蚕重要功能基因的克隆为出发点，在科学上重点揭示丝蛋白合成、性别决定、免疫和发育的遗传机制，探讨家蚕产量、质量和抗病性等重要经济性状形成的分子机理；在技术上解决如何利用基因工程改良家蚕品质，通过遗传调节提高家蚕生产性能问题。拟解决的科学问题的具体内涵是：11家蚕品质改良的理论基础 丝蛋白合成和抗性是两个家蚕主要的生产性状，其改良的理论基础是遗传机制。其中，茧丝是丝绸产业的原料，是行业产量和质量效益的主要决定因素。虽然蚕茧品质和产量性状主要由多基因支配，但其分子基础是丝蛋白的合成。因此，有哪些基因参与了丝蛋白的合成？它们形成了什么样的生化途径？是两个首要解决的问题。其次，要回答主要结构基因（丝素、丝胶和p25基因）的调控领域结构，相关的调控因子是什么？主要结构基因全序列在不同遗传材料中的多态性是什么？以及主要基因的蛋白质产物特征是什么等问题，这是探讨茧丝质量和产量形成遗传基础的关键。而抗病性是家蚕另一个主要经济性状，如何提高家蚕的抗性？其关键在于了解家蚕对病毒、细菌和真菌等主要病原微生物的免疫机制。由于家蚕抗微生物肽是其主要的抗菌分子，因此，在已经获得了家蚕主要抗菌肽基因的基础上，重点要回答这些基因的具体抗菌功能是什么，通过对不同抗性材料的研究，回答主要免疫基因与抗性形成的关系是什么等问题，最终了解家蚕抗性性状形成的主要遗传机制。性别决定和发育是家蚕另外两个重要的性状，它们决定产业的结构和效益。性别和发育的改良途径是进行人为的干预和调节，因此研究的关键是寻找鉴定靶基因。对于性别决定而言，其靶基因必须符合两个基本条件：一是处于调控网络的上游，才能实现彻底的性别调节；二是雌为有功能而雄为无功能形式，才能满足基因干涉的需要。这就需要回答家蚕性别决定关键基因是什么和相互关系是什么，在此基础上，重点确定性别网络上游的，雌为有功能形式和雄为无功能形式的特异基因。对于家蚕变态发育而言，涉及的基因数量多，克隆也相对容易，但是研究表明，大多数基因的干涉将会造成蛹死亡，或者影响其他发育进程的顺利进行。因此，发育调节靶基因也必须符合两个基本要求：一是处于调控网络的上游，二是必须具有严格的时期特异性。激素和激素受体基因处于整个调控网络的最顶端，是项目要研究的重点对象。要解决的基本问题是参与蛹到蛾变态的激素和受体基因有哪些，作用方式和特征是什么等。 12利用功能基因创造新型素材如何利用功能基因涉及两个关键科学问题和两个技术层次。两个关键问题是：一为以与产业密切相关的主要经济性状分子机理研究为基础，针对目前家蚕品种在产量和质量上的主要缺陷，影响结构效益的产业发展的主要限制因素，对家蚕经济性状进行分子改良；二是创造性地利用家蚕蛋白质合成能力，建立丝腺生物反应器，生产高附加值的生物工程和医药产品。要完成上述问题，在技术上分两个层次进行：首先建立转基因家蚕技术，解决知识产权和效率问题；其次是通过对目标基因进行分子改良，解决面向实用品种的遗传素材创新问题。围绕以上关键问题，计划从四个方面开展研究：(1)精细图谱构建、图谱整合和基因定位技术研究为解决基因分离和功能鉴定的规模和效率问题，在家蚕基因组框架图的基础上，重点开展以下几方面的研究：通过对现有家蚕基因组序列信息资源的整合，统一拼接组装，增加序列图谱的覆盖，充分利用已有EST和全长cDNA资源，完善基因组注释，构建精细图谱；在目前已有表达信息的基础上，研究关键发育时期和组织的SAGE分析，建立系统的家蚕基因表达图谱和数据库；构建并整合分子连锁图谱和经典遗传图谱；重点开展基于遗传图谱的基因定位技术研究，并利用遗传资源（突变系统）对重要基因进行定位。(2)重要基因的功能鉴定与分子机理研究解决关键基因的功能鉴定、阐明重要经济性状的遗传调控机理是项目的核心。通过基因组序列分析，我们已经初步确定了丝蛋白质结构基因调控领域和相关物质代谢基因，变态发育过程中的激素和受体基因，与微生物抵抗相关的抗菌肽基因和以Fem和Bmdsx为中心的性别信号传导基因等一系列重要的功能基因。重点对上述关键开展以下几方面的研究： 基因的完整序列和结构（包括全长基因组序列、全长cDNA序列），表达特征，基因结构多态性，调控方式和调节因子，对重要性状的影响和在基因互作网络中的地位和作用，小分子mRNA、小肽功能，病原体（如NPV）与宿主细胞相互作用分子机理研究，遗传调节（低表达或基因敲除，超表达或者功能获得）的生物学效应，在转基因家蚕中的应用基础等。总体上讲，通过研究，本项目将阐明家蚕重要经济性状的分子基础，拓展家蚕生物学基础理论，探索大幅度提高蚕茧品质和行业整体效益的新途径。(3)蛋白质图谱构建和重要蛋白质鉴定主要目的是解决家蚕DNA序列与功能进一步联系和功能基础数据积累的问题，重点开展以下几方面的研究：建立主要发育时期以及不同组织器官的蛋白质标准图谱；利用蛋白质组学技术鉴定与主要经济性状相关的蛋白质，重点开展比较蛋白质组学研究，研究主要蛋白质时空变化；探索性地研究蛋白质后翻译修饰加工以及其对蛋白质功能的影响；建立家蚕主要蛋白质数据库。(4)基因组应用基础和应用领域拓展研究主要目的是解决基因功能的生物学验证和产业应用问题，重点开展以下研究：研究高效、规模化转基因家蚕技术体系；克隆能满足各种基因定位表达需要的特异启动子，研究外来基因的表达控制；通过转基因和基因工程验证关键基因功能；研究建立基于基因工程的家蚕经济性状分子改良技术；创造新型的遗传素材。重点开展家蚕丝腺作为生物反应器研究，解决基础载体构建、转基因系建立、研究蛋白质表达效率的影响因素和提高技术；探索外源蛋白质纯化技术基础。二、预期目标1. 总体目标 项目总体目标是通过开展家蚕功能基因组研究保持我国蚕丝业的可持续发展，改变产业结构提高效益为解决“三农”问题服务，并带动我国蚕学和昆虫学的长远发展。具体科学目标主要是：充分发挥已绘制成功的家蚕全基因组序列框架图优势，加强后续研究力度，进一步确立和巩固我国家蚕功能基因组研究在国际上的地位；综合利用基因组和功能基因组研究的最新手段，通过对家蚕重要经济性状相关的功能基因的研究，在理论上基本阐明家蚕绢丝蛋白质合成、发育变态、免疫与微生物抵抗性等重要性状的遗传机理；在技术上建立包括基因定位、蛋白质组学研究和转基因工程的核心体系，在确定关键可利用基因的基础上，针对我国蚕丝产业急需解决的问题，创造新型素材；建立家蚕昆虫工厂的基础体系，拓展家蚕基因组的应用领域。为蚕桑学科培养和造就一批富有创新力，具有国际影响的中青年学术带头人和技术骨干。2. 五年预期目标（1） 构建四个体系，一是以基因组精细图谱、基因表达图谱、遗传图谱和遗传资源分析等为基础的家蚕重要功能基因定位克隆体系；二是建立以蛋白质组学、基因功能获得和丧失以及分子生物学技术为主体的家蚕基因功能研究确认体系；三是建立以转基因蚕、基因干涉和基因改造等基因工程等技术为主体的家蚕重要功能基因应用体系和素材创新体系；四是建立家蚕生物工厂的基础体系。（2）分离克隆200个控制家蚕绢丝蛋白质合成、家蚕发育变态、家蚕免疫和微生物抵抗性等重要经济性状的候选功能基因，对其中15个关键基因进行重点研究，弄清其结构和表达特征、生理生化功能、调控因子和调控方式，以及基因间的相互作用关系和生物学意义；探索其中10个功能基因转基因操作或者改造方法。（3）建立20个主要时期和不同组织器官的高丰度蛋白质图谱，质谱鉴定3000个以上的蛋白质；获得家蚕主要蛋白质组织特异性表达以及翻译后修饰加工的初步信息，建立家蚕蛋白质组学数据库。建立家蚕小分子mRNA、特别是小活性多肽库，初步完成13个具有重要价值的功能性蛋白。（4）阐明四个机理，初步阐明家蚕绢丝腺中丝蛋白质高效合成的分子机理，阐明家蚕蛹变态的分子机理，阐明家蚕主要免疫分子基础和对微生物抵抗性的分子机理；阐明家蚕性别决定的遗传机制。（5）创造四个类型的新型遗传素材，通过转基因等基因操作技术，探索创造外源基因在家蚕丝腺特异表达的遗传素材、家蚕“永久蛹”遗传素材、高抗性素材和性别调控（雄蚕化）素材，每一个类型将分别创建13个具体的遗传素材；在素材的基础上将探讨获得新型品种，对成熟的品种进行实用化研究。（6）出版专著24部，获基因专利10个， 在国内外核心刊物发表论文250300篇，其中有重要影响的论文50篇以上，并发表23篇有重要理论突破的高水平研究论文；培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次的科技新人，其中包括硕士研究生200名、博士研究生100名和博士后15名。三、研究方案1总体研究思路本项目的总体思路是：将家蚕全基因组工作框架图、家蚕功能基因注释信息和家蚕资源作为整个项目的基本出发点，综合运用基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学和分子生物学的方法和技术，通过从框架图到精细图谱到基因定位研究和从基因到功能到相互作用研究，克隆家蚕丝蛋白合成、性别、免疫和发育变态的关键基因，鉴定其功能，阐明其主要机理。通过从基因到素材创新研究，实现重要经济性状的遗传调节和改造，奠定产业实际应用的基础。2技术路线针对不同的目标基因，制定不同的技术路线：对于丝蛋白合成和抗性相关基因，由于研究重点在基因的相互作用和机理，因此主要技术路线是通过比较基因组学和生物信息鉴定网络中的关键节点基因，通过基因的调控领域分析研究基因的相互作用。而对于性别决定和发育变态相关基因，重点是实现人为干预和遗传调控，因此主要技术路线是通过基因表达特征和功能研究，确定符合调控要求的目标靶基因。基因的功能鉴定是整个项目的关键，总体上将利用基因表达谱分析、蛋白质组学、转基因和基因干涉等技术，对相关数据进行综合分析，以提高分析效率。具体采用以下三条技术路线：（1）在已有工作基础上，从家蚕基因结构信息的解析到基因表达特性分析。将主要通过对家蚕基因组信息的深层次分析研究，结合cDNA文库的构建、大规模EST测序和基因表达分析，达到研究家蚕功能基因的结构信息和表达特征目的。（2）利用蛋白质组、遗传图谱和转基因等基因功能的高效研究手段，准确地分析研究目标基因的功能。（3）从我国丰富的家蚕遗传资源的分析到重要家蚕功能基因的分离，包括两个主要方面：一是对基因转录的时空特异性进行分析，研究功能基因表达与家蚕发育变态、性别和品质形成的关系；二是通过家蚕物理图谱、分子图谱的构建，利用家蚕重要遗传突变体和近等位基因系，定位克隆家蚕重要功能基因。充分利用近缘昆虫如果蝇的基因组信息，通过比较基因组研究也是本研究技术路线的重要组成部分。总体技术路线示意如下：鳞翅目害虫特异基因遗传图谱精细图谱素材创新产业技术进步生物医药丝蛋白合成、性别、免疫与发育功能基因克隆整合图谱转基因、干涉蛋白质产物基因功能与性状的遗传机理遗传资源框架图生物工厂比较基因组基因相互作用3创新性（1）本项目不仅是家蚕，也是鳞翅目昆虫领域基因组的第一个重大科技行动。项目基于我国的特殊资源优势和强大产业需求，将家蚕重要功能基因和其产业应用作为主要目标，因此与国际家蚕基因组和功能基因组研究计划相比，更加注重产业化应用导向。项目所重点涉及的家蚕性别决定、发育和变态、重要经济性状形成的分子机理研究等内容，在理论上属于前沿和开拓性课题，应用上切中我国蚕丝业质量和效益要害，因此与蚕丝产业技术传统研究相比，具有理论上的先进性和技术方案的高效性。项目集中体现了基础研究和应用研究的有机结合。（2）在研究手段上，本项目有机结合生物信息学、基因组和功能基因组分析技术，以大规模功能基因分析和基因定位分析为基础，高起点、高通量、高效率直接切入家蚕功能基因组的基础和应用研究，即基因发现、功能分析和应用基础研究同步进行，一次到位，体现了学科交叉优势和科学发展的新趋势。（3）第一次全面融家蚕资源平台、基础研究平台和产业技术开发平台为一体，从基因组信息出发，全面分析参与重要性状形成的可能功能基因目标。研究路线具有全面性和系统性，是解决蛋白质合成、发育变态、免疫和性别等复杂过程的可靠路线。（4）项目涉及的家蚕丝腺工厂和害虫防治应用内容，具有一定的开拓性。4可行性分析项目承担单位近年来共计完成了家蚕相关研究项目50余项，包括6项“863”计划，12项“九五”和“十五”重大科技攻关项目，2项国家自然科学基金重点项目和35项面上项目，完成了项目的基础积累。在工作保障方面，先后召开了多次全国性家蚕功能基因组讨论会，初步整合了我国功能基因组学和家蚕研究两方面的优势力量，形成了有效的协作组织，各成员单位均开展了具体的前期研究。如中科院将家蚕基因组研究作为第二期知识创新项目启动，投入200余万元用于家蚕微卫星图谱构建和功能基因定位克隆研究；西南农业大学建成了世界规模最大的家蚕资源库，通过承担并完成与本项目相关的“973”预研任务，完成了家蚕功能基因组研究的重要基础性工作，所取得的研究成果在国际上产生了重要影响，为本项目的开展开辟了良好的国际合作空间。特别重要的是，重庆市政府已决定集中投入2000万元，用于建设高水平的蚕桑学重点实验室，形成一个开放的家蚕功能基因组研究平台，全面支撑本项目的开展。因此，通过立项，集成优势，紧密合作，我们完全可以在家蚕基因组研究上做出十分出色的成绩，为丝绸之路增添异彩，为民族产业的发展做出历史性贡献。5. 课题设置按总体研究目标和思路，将本项目分解为5个课题进行，具体目标和主要研究内容如下：课题1、家蚕基因组图谱整合与基因定位研究研究目的：利用目前所取得的家蚕基因组序列和图谱信息，在框架图的基础上构建家蚕全基因组精细图；整合家蚕基因组图谱和分子连锁图谱，将序列信息定位到染色体和连锁群；建立家蚕基因定位理论和技术体系，定位克隆重要的突变基因。主要研究内容：（1）家蚕全基因组精细图谱综合现有信息，拼接、组装并重新注释家蚕全基因组，利用物理图谱将基因组序列的绝大部分定位在染色体（连锁群）上，发表家蚕全基因组精细图谱。目前家蚕基因组框架图覆盖深度是6X，覆盖率为95%。因此，本课题的首要任务是：进一步增加覆盖深度和广度，使家蚕基因组序列图谱达到9X以上，覆盖率达到99%以上的精细图标准。家蚕染色体数为28对，其中雌为ZW，雄为ZZ型，为了使初期构建的图谱均匀覆盖所有的染色体，框架图的构建采用了雄个体，不包括28对染色体中的雌性染色体（W染色体）。经典遗传研究证明，W染色体上的雌性决定因子Fem是家蚕性别调控的初始信号因子，对性别起决定性的作用。因此，本课题将在精细图谱的构建中还将重点解决W染色体的序列问题。该部分研究将主要通过国际合作的方式，对目前国际组织的所有序列和图谱信息进行统一拼接、组装和注释。通过协商，已经原则同意投入的信息包括6X（中国）和3X（日本）共计9X的霰弹法测序信息，基于BAC克隆的11X物理图谱（日本）和BAC克隆末端序列（中国），近200Mb的BAC全测序信息（日本），14万条EST序列（中、日）以及2万余条全长cDNA测序（日本）等。以上信息的获得都使用了国际共同参照品种“大造”，所以从现有信息资源的深度和范围来看，在不追加测序工作量的情况下，基本上可以满足构建一张质量比较高的精细图谱的要求。（2）遗传图谱和物理图谱的整合家蚕遗传图谱具有十分丰富的研究积累，利用RFLP、RAPD、AFLP等分子标记，已经构建并发表了近十张分子连锁图，包含了近3000个位点。但是，各个图谱之间缺乏联系，信息不能共享，密度和精度也不能满足定位克隆要求。本课题拟利用微卫星SSR标记，建立高密度的分子连锁图谱。构建长插入片段质粒文库，获得可以利用PCR进行扩增的微卫星位点，构建至少含有2000个SSR标记位点的高密度连锁图。家蚕经典遗传图谱是近100年家蚕遗传和突变研究的主要成就，包含了200个左右有价值的突变基因信息。为实现遗传图谱和基因组图谱整合，课题将利用国际上通用的家蚕“大造”品系和C108品系作为作图亲本，构建含有28个连锁群的家蚕微卫星遗传连锁图。利用已有的形态标记，对家蚕微卫星遗传连锁图与传统的形态标记遗传连锁图进行连锁分析，发表整合图谱。（3）重要突变基因定位克隆研究突变基因是研究新基因和新功能最具有价值的资源，但是其克隆分离难度远比有具体产物或作用方式信息的基因大。基于连锁图谱的定位克隆将成为主要的和可行的分离鉴定方法，本部分研究的主要目的，是建立基于家蚕全基因组精细图谱和整合遗传图谱的突变基因定位体系，并定位和分离重要的突变基因。目前，我们已经建立了多个重要的家蚕突变近等位基因系统，包括家蚕病毒病抵抗突变系（DNV-z和nsd-Z），发育突变系（蛹期延长和致死），丝蛋白质合成突变（丝胶缺乏）等。以此为基础，课题将利用标记体系对上述家蚕突变进行连锁分析，把突变基因定位于整合连锁图谱；获取与性状紧密连锁的分子标记，根据标记和位置信息，确定突变基因在全基因组图谱上的物理范围；对所确定范围内的所有基因进行信息分析，确定候选基因，并通过功能分析最终克隆分离控制突变性状的基因。预期目标： 1、总目标在家蚕基因组框架图，全长cDNA和遗传连锁图的基础上，通过国际合作构建家蚕精细图；构建高密度的家蚕遗传连锁图，实现多种分子标记遗传连锁图的整合，以及经典形态标记连锁图与分子标记遗传连锁图和遗传连锁图与物理图谱的整合；建立完善的家蚕基因定位克隆平台和功能研究平台，为家蚕重要目标基因的定位克隆和功能研究创造条件。2、五年预期目标(1)构建家蚕全基因组精细图谱。目前所有家蚕基因组信息资源已经包括了6（中国）和3（日本）共计9的霰弹法测序信息，基于BAC克隆的11物理图谱和BAC克隆末端序列，近200Mb的BAC全测序信息，14万条EST序列，基于SSR、RFLP和RAPD的遗传连锁图谱共计近3000个分子标记，经典连锁遗传图谱共计200个标记，以及2万余条全长cDNA测序等。通过对这些信息资源的整合，统一拼接组装，增加序列图谱的覆盖，充分利用已有EST和全长cDNA资源，完善基因组注释，进一步增加覆盖深度和广度，使家蚕基因组序列图谱达到9X以上，覆盖率达到99%以上，并与分子连锁遗传图谱和经典遗传图谱进行整合，将绝大部分DNA序列信息定位在染色体（连锁群）上。(2)实现分子标记与经典形态标记的整合，遗传图谱与物理图谱的整合，建立家蚕重要功能基因定位克隆体系。在已经构建的含有550个微卫星标记遗传连锁图的基础上，提高微卫星标记的密度，使微卫星标记的数量达到12001500个；利用微卫星标记共显性的特点，实现不同分子标记之间的整合，建立起目前已有的3000多个有效标记（RAPD, AFLP等）之间的有机联系，以便进一步提高遗传连锁图的遗传标记密度；在微卫星标记和经典形态标记的基础上，实现分子标记遗传连锁图与形态标记遗传连锁图的整合，使每一个分子标记的连锁群上都拥有12个形态标记；构建家蚕物理图谱并实现微卫星标记遗传连锁图与物理图谱之间的整合。(3)重要基因的定位克隆。对家蚕完全不感染性抗浓核病基因DNV-z进行定位克隆，揭示单基因抗病性的主要特点。同时对发育突变系（蛹期延长和致死）基因，丝蛋白质合成突变（丝胶缺乏）基因进行定位克隆并对SAGE研究中发现的10个家蚕特有的蛹期特异基因进行功能研究，以期揭示这些基因在蛹发育过程中的作用。(4)获基因专利12个， 在国内外核心刊物发表论文2936篇，其中有重要影响的论文6篇以上；培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次的科技新人，其中包括硕士研究生20名、博士研究生10名和博士后3名。建议承担单位： 中科院上海植物生理生态研究所 中科院北京基因组研究所建议课题负责人： 黄勇平 中科院上海植物生理生态研究所 王 俊 中科院北京基因组研究所学 术 骨 干： 徐世杰 国家人类基因组南方研究中心 苗雪霞 中科院上海植物生理生态研究所经 费 比 例： 10%课题2、家蚕重要经济性状功能基因研究研究目的：针对基础理论和产业发展关键问题，分离克隆与性别、抗性、发育和丝蛋白合成等重要经济性状相关的功能基因，阐明这些经济性状的遗传机理。该课题作为项目的核心。主要研究内容：（1）家蚕性别相关基因的克隆与性别决定机制研究经典遗传学研究证明，家蚕W染色体上存在着一个雌决定因子Fem，即只要有W染色体的存在，无论Z染色体和常染色体的多寡，个体均发育为雌。除此初始信号之外的下游信号传导机理，则基本不清楚，但推测与果蝇性别决定机制有相当保守的共同点。家蚕基因组大规模测序，使家蚕性别决定机制的研究取得了重要突破：发现了家蚕的dsx基因（Bmdsx），其与果蝇的dsx基因一样，是雌雄分化的开关调节因子，通过该基因不同的拼接方式决定了个体的性别命运。但是，与果蝇dsx不同，Bmdsx基因的欠缺型拼接为雌特异型，而雄型拼接则没有第3、4外显子，由此估计，一个活化的阻遏物参与了该过程的调节。本研究的主要内容是分离、克隆参与家蚕性别决定的关键功能基因。由于像开关基因Bmdsx那样雌雄特异形式不同的基因并不能成为理想的由雌到雄的调节靶，因此研究重点将是W染色体（Fem）初始信号以下，dsx以上调控过程的关键基因；研究这些基因的表达特征、产物特性和作用方式；特别是寻找以Fem，Bmdsx为主的可以实现性别遗传调节的功能基因，较为详细地阐明家蚕性别决定的主要遗传基础和分子机理；基于获得的功能基因信息，利用RNAi对家蚕性别调控和发育变态关键的基因进行干涉，特异关闭雌发育通道，实现人为调控的目的。（2）家蚕发育与变态相关功能基因研究分离、克隆控制家蚕发育变态，重点是从蚕蛹到成虫（蚕蛾）阶段的关键基因，重点研究包括蛹变态期MH诱导下变态发育的分子机制，JH与MH调控下幼虫蜕皮发育的分子机制。鉴定发育调控网络中相关激素信号传导的各种已知和未知的受体因子、转录因子和调控因子，研究它们的结构、功能和相互作用的关系，为最终阐明家蚕幼虫蜕皮与成虫变态发育的级联调控系统奠定基础。研究近缘昆虫如野蚕、柞蚕和蓖麻蚕等蛹期发育突变，探讨基因多态型与变态特征的关系，寻找发育调节的可行途径。利用转基因和基因干涉技术，建立家蚕“永久蛹”系统的技术途径。（3）家蚕抗微生物肽和抗性相关基因和功能研究利用生物信息学方法，详细研究所有家蚕抗菌肽基因的结构、所编码蛋白质/多肽、基因组中的分布和构成、系统进化关系、转录前后的调节方式以及可能的调控元件。利用细菌（革兰氏阴性和阳性细菌、真菌）注射血液，对家蚕进行诱导，在mRNA水平上研究各类家蚕天蚕素、抗菌肽、类免疫球蛋白等重要血液抗菌基因在诱导后的表达情况，并在蛋白质水平上检测抗菌肽产物的合成；家蚕幼虫和蛹是抗菌肽基因作用的主要时期，因此，本课题将系统比较各个基因在家蚕这两个时期的作用，系统比较各个基因之间应答的特征，并进行分类。结合防御病原微生物入侵和增殖相关基因的功能研究，利用基因表达分析和RNAi等方法，在个体水平上研究各个免疫相关基因的生物学意义，通过对重要基因进行干涉，研究其干涉后基因产物的消减和家蚕成活的关系，探讨这些基因在家蚕防御中的重要性。（4）家蚕丝蛋白质高效合成相关基因研究通过生物信息学的方法，详细检索丝腺基因群的上游调控序列，分析参与丝腺特异表达调控的结构元件的结构、分布、类别和可能的作用方式；将这些基因调控元件与已经发现的茧丝结构基因的调控元件进行比较，探讨它们在决定丝腺功能基因表达的时空特异性中的作用。对家蚕丝腺主要（高表达量）蛋白质进行严格鉴定。在充分详细的基因功能研究的基础上，将以丝心蛋白及其基因为核心，以其复制、转录表达、包装和分泌为主线，重建这一系统的信号转导途径。利用生物信息学、分子生物学、蛋白质组学以及结构基因组学的手段和方法，推测并鉴定参与丝心蛋白基因复制的调控蛋白、启动丝心蛋白基因表达的转录因子以及负责丝蛋白包装和分泌的蛋白质因子。构建其他家蚕丝腺蛋白质合成生化途径和相关功能基因作用位点图谱，结合基因干涉和传统分子生物学技术，研究主要功能基因群的表达时空特征、调控机理和相互作用方式；结合遗传资源和突变基因，探讨这些基因在丝腺蛋白质高效合成中的作用；阐明这些基因在茧丝品质形成中的作用；克隆重要的具有应用价值的功能基因。总的预期目标：综合利用基因组和功能基因组研究的最新手段，通过对家蚕重要经济性状相关的功能基因的研究，在理论上基本阐明家蚕绢丝蛋白质合成、发育变态、性别分化、免疫与微生物抵抗性等重要性状的遗传机理；探讨对这些主要经济性状进行遗传和分子改良的理论基础。具体目标和技术指标：分离克隆200个控制家蚕绢丝蛋白质合成、家蚕发育变态、家蚕免疫和微生物抵抗性等重要经济性状的候选功能基因。其中重点包括在丝腺重特异表达的合成酶系和调节关键基因；包括性别决定网络Fem以下，Dsx以上的如Sxl、tra、intersex (ix)、fruitless、rbp等；包括在与发育相关的激素合成代谢途径中起关键作用的酶以及激素受体（E93和E96基因；包括家蚕先天免疫和对微生物抵抗相关的基因如天蚕素基因等。对其中15个关键基因（家蚕性别调控网络中能够用于性别调节的靶基因，具有广谱抗菌的抗菌肽基因，发育调控网络中激素顶层调节基因以及丝蛋白质合成的关键调节因子等）进行重点研究，弄清其结构和表达特征、生理生化功能、调控因子和调控方式，以及基因间的相互作用关系和生物学意义；探索其中10个功能基因转基因操作或者改造方法。初步阐明四个机理，即初步阐明家蚕绢丝腺中丝蛋白质高效合成的分子机理，阐明家蚕蛹变态的分子机理，阐明家蚕主要免疫分子基础和对微生物抵抗性的分子机理；阐明家蚕性别决定的遗传机制。在国内外核心刊物发表高质量研究论文89-95篇，其中有重要影响的论文17-19篇。功能基因鉴定及基因专利申请：克隆180个重要的功能基因，对控制家蚕主要经济性状的6-8个关键基因进行重点研究，弄清其结构、功能和诱导表达特征及遗传调控方式。并申请有自主知识产权的关键调控基因和抗性基因专利6-8个。 培养中青年学术骨干5-7人；培养博士研究生30人、硕士研究生60人。建议承担单位： 西南农业大学 华南农业大学建议课题负责人： 夏庆友 西南农业大学 曹 阳 华南农业大学学 术 骨 干： 周丛照 中国科技大学 赵 萍 西南农业大学 程道军 西南农业大学 温硕洋 华南农业大学 潘国庆 西南农业大学经 费 比 例： 35%课题3、家蚕重要功能基因的蛋白质产物分析研究目的：利用蛋白质组学手段，获取家蚕主要蛋白质的动态和整体的信息，探讨蛋白质与重要经济性状的关系。主要研究内容：（1）家蚕重要组织器官蛋白质图谱构建利用高精度蛋白质双向电泳技术，对20个以上的家蚕各主要发育时期（卵、幼虫、蛹、成虫）的主要组织器官（家蚕血液、脂肪体、精巢、卵巢、消化器官中肠、丝蛋白质合成器官丝腺、皮肤、神经和分泌器官以及标准细胞株）中主要蛋白质进行分析，建立标准蛋白质图谱库。为提高蛋白质图谱的分辨率，其中2-D电泳将采用等电点和分子量分段建库，并利用图象分析系统和软件建立家蚕蛋白质的图谱信息库（包括分子量和等电点的精确数据）。（2）家蚕主要蛋白质的质谱鉴定利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF），建立蛋白质质量指纹图谱，测定这些多肽链的部分氨基酸序列；利用生物信息学检索方法，对家蚕主要蛋白质进行鉴定，即利用蛋白质质量指纹图谱，并结合源后裂解（PSD）测定的部分氨基酸残基序列，对照国际标准蛋白质库和家蚕全基因组信息由来的家蚕专一蛋白质理论指纹库，检索并鉴定3000个以上的家蚕蛋白质图谱库中可检测的蛋白质斑点，建立基因和蛋白质产物对应关系数据库。以此为基础，鉴定课题2所克隆的重要功能基因的蛋白质产物，从而在蛋白质水平研究这些基因的作用，研究其与主要经济性状的关系。蛋白质的翻译后修饰与加工对功能的调节极其重要。本课题还将利用蛋白质组学技术，研究重点蛋白质（包括所获得与经济性状相关的功能蛋白，时期、组织特异蛋白质）的修饰与加工（主要研究糖链附加和磷酸化修饰等），探讨翻译后修饰与加工对基因功能和性状的影响。（3）重要功能基因的比较蛋白质组学研究以上述（1）、（2）项研究为基础，研究家蚕蛋白质在时间和空间上的分布规律，重点探讨发育时期变动和组织特异性新的蛋白质，如性别特异蛋白质、丝腺特异蛋白质和蛹特异蛋白质等，重要性状相关功能基因的研究。接种主要家蚕病原微生物（DNV病毒、NPV病毒、微粒子、白僵菌和细菌），对比研究感病和非感病的蛋白质表达差异，发现与微生物抵抗性相关的蛋白质。由于普通蛋白质电泳只能检测高表达的蛋白质，功能上极其重要但表达丰度低的调节蛋白质因难以用常规电泳方法进行研究。因此课题还将采用ICAT（Isotope Coded Affinity Tages, 同位素标记亲和标签）技术、DIGE（Fluorescenc two-dimensional difference gel electrophoresis, 2-DIGE, 荧光胶内差异双向电泳）技术开展蛋白质比较研究，以提高表达丰度较低、功能比较重要的调节蛋白质的检测灵敏度，发现与性状相关的调节蛋白质。预期目标：（1）建立以蛋白质组学研究技术为主体的家蚕基因功能研究确认技术体系。（2）建立家蚕卵、幼虫、蛹、成虫4个主要发育时期的血液、脂肪体、精巢、卵巢、消化器官、丝腺、皮肤、神经和分泌器官等主要组织器官的20个以上高丰度蛋白质组标准图谱，并登录SWISS-2D-PAGE数据库。（3）质谱鉴定3000个以上的蛋白斑点序列，数据登录SWISSPROT数据库。（4）建立家蚕蛋白质组学数据库。获得关键基因在家蚕机体细胞中蛋白质产物的时空分布特征，以及翻译后修饰加工的初步信息，获得20个其他家蚕组织和时期特异性表达的蛋白质。（5）出版专著1部。在国内外核心刊物发表论文4653篇，其中有重要影响的论文69篇。培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次的科技新人，其中包括硕士研究生30名、博士研究生14名。建议承担单位： 浙江大学 重庆师范大学建议课题负责人： 钟伯雄 浙江大学 周泽扬 重庆师范大学学 术 骨 干： 鲁兴萌 浙江大学 缪云根 浙江大学 赵元莙 重庆师范大学吴小锋 浙江大学 徐豫松 浙江大学 经 费 比 例： 14%课题4、家蚕品质分子改良与素材创新研究研究目的：建立拥有自主知识产权的家蚕转基因技术，探讨主要经济性状的分子改良方法，创造新型家蚕遗传素材。家蚕外源基因重组到基因组的策略主要有同源重组和转座子两种，前者主要用于家蚕目的基因的改造和产生融合蛋白质，后者主要用于性状获得、基因过度表达甚至基因表达的关闭等。特别是近年研究发现，在粉刺蛾中发现的piggyBAC转座子载体，能高效地实现外源基因重组到家蚕基因组，获得能稳定遗传的转基因家蚕。但是，目前利用piggyBAC的转基因技术受国际专利保护，只对非赢利的科学研究开放使用。通过家蚕基因组计划的实施，我们发现大量家蚕自身转座元件，包括家蚕类piggyBAC因子等，基本满足家蚕转基因技术体系构建的需要。初步的研究也表明，利用家蚕自身转座元件，构建拥有独立知识产权的技术是完全可行的。主要研究内容： （1）家蚕高转基因平台和转基因安全研究开展家蚕转基因技术平台的研究，一方面通过功能基因的导入，研究转基因蚕的生化反应和代谢生理的变化，为家蚕基因功能的研究与鉴定奠定基础，另一方面，十实现家蚕发育变态和性别决定调节，对家蚕品质进行分子改良和素材创新必不可少的条件。本部分的研究将利用微量注射和家蚕类piggyBAC转座子载体系统，建立高效稳定的家蚕转基因技术系统；研究功能性基因导入对家蚕生理和生化的影响；开发适用于性状定向改良的转基因技术。当前，转基因安全是必须与转基因研究同步考虑的重大问题，特别是已经发现了鳞翅目昆虫具有piggyBAC类似的转座位点和机制，因此可能存在安全隐患。课题将搜索家蚕全基因组，寻找家蚕基因组中的piggyBAC类似序列，研究其自身转座酶的活性；通过比较主要鳞翅目昆虫的同源体，分析转基因家蚕相对于其他家蚕品种和其他昆虫的安全性。（2）家蚕外源基因的时空调控表达系统研究利用转基因及转基因干涉技术体系，研究家蚕功能基因的改造、特定基因的过剩表达和基因敲除等；利用GAL4/UAS系统和组织器官特异性表达基因启动元件（如丝腺重链启动子等），研究在家蚕中定点、定时表达外源基因，以限定在杂交一代实现家蚕性别转换和变态调节等。（3）基于遗传工程的新型家蚕遗传素材创新研究建立家蚕重要性状和突变基因的近等基因系和近交系，筛选与家蚕实用性状相关的分子标记，为分子标记辅助育种奠定基础；针对目前蚕丝产业中的主要待解决的问题，利用转基因技术体系，在实用品种的基础上，创造外源基因在家蚕丝腺特异表达的遗传素材、家蚕“永久蛹”遗传素材、高抗性素材和性别调控（雄蚕化）素材。预期目标：(1)鉴定家蚕基因组中的piggyBAC类似序列；建立以微量注射和piggyBAC转座子载体为主的高效、安全的家蚕转基因技术体系，为验证不同类型基因的功能和定向改良家蚕性状奠定基础；(2)通过转基因技术和基因干涉技术体系，研究功能基因的改造、过剩表达和沉默，明确外源基因在蚕体组织器官特异表达的时空调控规律；(3)建立与完善家蚕重要性状和突变基因的近等基因系和近交系，筛选获得3-5个实用性状（如蚕茧产量与质量、抗性、摄食性等）相关的分子标记，建立家蚕分子标记辅助育种技术体系，创制5-7个新种质；(4)利用转基因等基因操作技术体系，创造和培育外源基因在家蚕丝腺特异表达的遗传素材、家蚕“永久蛹”遗传素材、高抗性素材和性别调控（雄蚕化）素材，获得转基因品系4-6个；(5)申请发明专利5-7项，在国内外核心刊物发表论文51-60篇，其中有重要影响的论文9-13篇；培养硕士研究生30名、博士研究生10名左右。建议承担单位： 西南农业大学 中国农业科学院蚕业研究所建议课题负责人： 鲁 成 西南农业大学郭锡杰 中国农业科学院蚕业研究所学 术 骨 干： 李 斌 西南农业大学代方银 西南农业大学沈兴家 中国农业科学院蚕业研究所李木旺 中国农业科学院蚕业研究所 唐顺明 中国农业科学院蚕业研究所 徐安英 中国农业科学院蚕业研究所经 费 比 例： 23%课题5、家蚕生物工厂及基因组应用的拓展研究利用昆虫病毒表达载体系统，迄今为止成功在家蚕体内合成了400余种有用蛋白质，部分产品已经面市。家蚕蛋白质合成的高效性、高等生物蛋白质的后修饰加工能力、生产的大规模低成本优势以及对人畜安全性等，满足了新一代生物反应器的基本要求，有巨大的开发应用潜力。本课题的研究目标是：利用转基因技术，探索建立以家蚕绢丝腺为载体的生物合成工厂模式，探索家蚕功能基因组基础理论和技术在鳞翅目昆虫上的拓展应用。主要研究内容：（1）家蚕丝腺生物工厂基础体系家蚕丝腺生物工厂基础体系中必须包括三个要素，即外源蛋白质在丝腺的特异表达，具有较高的表达量，具有生物活性。因此，本课题将克隆p25、FibL和FibH等丝腺特异基因的上游启动子序列，利用转基因家蚕体系，向家蚕基因组插入外源基因序列，并实现在丝腺的特异表达；在丝蛋白质缺乏（如丝胶蚕）突变系统中建立外源基因插入系统，以提高蛋白质的表达量；结合课题3的基础，研究丝腺中蛋白质分泌和加工的特性，建立能生产具有生物活性的外源蛋白质体系。（2）利用丝腺工厂生产高附加值蛋白的产业化基础家蚕属于高等真核生物，具有对蛋白质进行修饰加工的能力，这是家蚕表达系统较之于大肠杆菌等的主要优势。因此，家蚕生物工厂最适合生产其他表达系统难以解决活性问题的蛋白质。本部分研究的内容，是利用已经构建成功的人成骨生长因子和副流感病毒幼苗转基因蚕载体，获得丝腺表达外源蛋白质的转基因蚕，探讨其产业化（包括蛋白质活性和下游纯化等）关键问题。（3）作为模式昆虫在农林害虫防治上的应用为拓展家蚕功能基因组研究的应用，适当布置力量探索性研究鳞翅目害虫特异基因，为进一步研究积累经验。主要将利用比较基因组学方法，研究鳞翅目主要害虫的分子进化关系；分离克隆25个鳞翅目昆虫（以棉铃虫为主）与味觉嗅觉、发育致死和Bt抗性等相关的功能基因；以家蚕为模式，研究昆虫植物和昆虫微生物之间的相互作用关系，探索突变基因和遗传不育在害虫防治中的应用。1.总体目标：利用转基因技术，探索建立以家蚕绢丝腺为载体的生物合成工厂模式，探索家蚕功能基因组基础理论和技术在鳞翅目昆虫上的拓展应用。2.五年预期目标（1） 建立家蚕丝腺生物工厂基础体系，构建34个通用的家蚕丝腺生物工厂的转基因载体；（2） 建立利用丝腺工厂生产高附加值蛋白的产业化技术体系，获得丝腺表达外源蛋白质的转基因蚕素材45个；（3） 探索鳞翅目主要害虫的杀虫剂抗性的分子进化以及昆虫与植物的协同进化，获得25个鳞翅目昆虫（以棉铃虫为主）与味觉、嗅觉、发育致死和Bt抗性等相关的功能基因；（4） 建立利用家蚕生产生物杀虫剂的基础体系；探索突变基因和遗传不育在害虫防治中的应用；（5） 获基因专利23个、家蚕丝腺生物工厂相关专利13个， 在国内外核心刊物发表论文2535篇，其中有重要影响的论文57篇；（6） 培养和造就35名中青年学术带头人和不同层次的科技新人，培养硕士研究生1520名、博士研究生1012名。建议承担单位： 苏州大学 西南农业大学建议课题负责人： 沈卫德 苏州大学 何宁佳 西南农业大学学 术 骨 干： 贡成良 苏州大学 徐世清 苏州大学 潘敏慧 西南农业大学 薛仁宇 苏州大学 司马杨虎 苏州大学经 费 比 例： 10%课题6、家蚕及病原物的小mRNA、小肽功能研究细胞内小分子RNA及小分子肽类物质在生物体发育过程中对基因的差异表达、mRNA剪接的调控、染色体端粒的维持等方面的功能日益受到重视。在这里我们主要解决两个问题，一是研究家蚕细胞与病原物基因组中的小分子mRNA和小肽分子结构与功能，二是研究小分子mRNA和小肽分子与相关基因转录、表达、调控和DNA复制的关系。主要研究内容：（1）家蚕小分子mRNA和小肽研究研究在家蚕生长发育过程中小分子RNA和小肽的种类、分子结构和数量，建立小分子RNA和小肽数据库；研究小分子RNA和小肽生物学功能。寻找家蚕发育过程中的关键蛋白，为家蚕主要经济性状改良提供新的靶点；寻找具有重要价值的活性小肽；建立与蛋白稳定相关基因在生长发育、代谢调控和环境应答等的基因表达谱，研究关键基因的功能。（2）小分子mRNA和小肽分子与转录、表达、调控和DNA复制的关系主要研究小分子mRNA和小肽分子与DNA复制以及在转录和表达水平上与其他基因的相互关系。五年预期目标：（1）建立家蚕和病原物的小分子RNA及小分子肽与药用相关的基因文库和活性多肽库。初步完成610个与发育或者药用相关的完整基因及其蛋白功能的研究；分析家蚕新神经肽基因对家蚕生长发育的调控机理；获得通过小mRNA进行遗传调节的素材12个；（2）分析鳞翅目昆虫变态发育过程中气管发育、细胞凋亡的主要信号传导途径；（3）在丝腺细胞内基因组多倍化和蛋白分选的调控机制研究方面取得进展；（4）定量地掌握感病品种BmNPV在不同组织、时期复制和增殖情况；查明目前所发现的唯一家蚕抗BmNPV病品种哪个组织部位是BmNPV失活或者被抑制的屏障以及机理；（5）获得家蚕抗BmNPV病相关的主要蛋白及基因23个；阐明BmNPV病毒P74、gp64等主要基因的家蚕宿主的受体蛋白及其相互作用机理；培育出家蚕抗BmNPV新种质12个；（5）发表SCI论文1924篇左右，其中具有重要学术价值论文69篇，申请中国发明专利34项以上。培养博士生5人，11硕士研究生8人。建议承担单位： 浙江理工大学 建议课题负责人： 张耀洲 浙江理工大学 学 术 骨 干：吴祥甫 浙江理工大学 张志芳 中国农业科学院生物技术研究所徐卫华 中国科技大学生命科学学院 陈克平 江苏大学 陈 建 浙江理工大学经 费 比 例： 8%6课题关系家蚕基因组图谱整合与基因定位研究（课题1）是功能基因大规模筛选鉴定的基础，家蚕重要经济性状功能基因研究（课题2）是整个项目的主体，家蚕重要功能基因的蛋白质产物分析（课题3）是基因功能鉴定的必要手段和补充，家蚕品质分子改良与素材创新研究（课题4）是分子改良研究的主体，家蚕生物工厂及基因组应用的拓展研究（课题5）是功能基因组应用研究的拓展，家蚕及病原物小mRNA和小肽功能研究（课题6）是前5个课题研究内容的必要补充。四、年度计划研究内容预期目标第一年1整合国际家蚕全基因组数据，建立高密度的微