答辩--蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素的脱除技术.ppt

毕业论文蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素脱除工艺的研究 姓名 汤晓娟专业 生物工程指导教师 何荣军 蔡成岗时间 2008 12 10 一 课题研究背景和意义 1 1课题研究背景 蜂王浆有增强免疫力 防癌抗癌 抗衰防老 健脑益智 促进生长发育 抗菌消炎 抗辐射 促进组织再生 增强造血功能 调节血压 防止动脉硬化 保护肝脏 催眠 强化性功能以及美容润肤等多方面作用 其中 尤其值得一提的是在抗衰防老 延年益寿方面的良好作用 但蜂王浆里含有氟喹诺酮类抗生素 吸收好组织浓度高氟喹诺酮类抗生素的特点抗菌谱广与其他抗菌药物无交叉耐药性 1 2课题研究的意义 1 2课题研究的意义 氟喹诺酮类残留除了其副作用直接危害人类外 更严重的问题是食品中残留低浓度的药物可能使人的致病菌产生耐药性 从而使氟喹诺酮类药物对人类疾病的疗效降低甚至失效 同时使新开发的氟喹诺酮类药品的市场周期大大缩短 据相关报道所知 我国某些蜂王浆产品抗生素含量有超标现象 从而导致产品频遭退货 严重影响了蜂王浆的出口 因此 脱除氟喹诺酮类抗生素是非常重要的 二 研究内容分别采用溶剂法 离子交换法和印迹法脱除蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素 主要指诺氟沙星 氧氟沙星 环丙沙星和恩诺沙星 评价这几种方法对蜂王浆中有效成分 蛋白质和癸稀酸 含量的影响 三 研究材料 方法和手段 3 1研究材料3 1 1原料 蜂王浆3 1 2试剂 磷酸盐缓冲溶液 柠檬酸 甲醇 乙腈 甲苯 甲基丙烯酸N N 亚甲基双丙烯酰胺 偶氮二异丁腈 乙醇 盐酸3 1 3仪器 离心机 OasisHLB固相萃取柱 紫外可见分光光度计 液相色谱仪 干燥箱 分析天平 酸碱滴定管 有机滤膜 3 2研究方法和手段 抗生素的脱除的方法 溶剂法 离子交换法 印迹法抗生素测定方法 液相色谱法有效成分含量的测定 脂肪和癸烯酸脂肪的测定方法 凯氏定氮法癸烯酸的测定方法 液相色谱法 3 3 2抗生素的脱除 溶剂法 乙酸乙酯 加萃取剂 蜂王浆 混匀充分震荡提取 萃余液 回收有效成分 萃取液 合并 冷冻干燥得产品 离子交换法用阴阳离子交换双柱脱除氟喹诺酮类抗生素洗脱 蜂王浆加水稀释 用阴或阳离子柱吸附 收集未吸附组分 冷冻干燥得产品 分级洗脱 分部收集 收集已吸附组分 印迹法 MIPs模板分子的制备及提取 MIPs的制备 MIPs吸附性能的测定 吸附蜂王浆中的抗生素 蜂王浆水溶液 离心 上清液 沉淀物 蜂王浆 回收洗脱MIPs 冷冻干燥得产品 干燥MIps 3 4氟喹诺酮类抗生素含量的测定 液相色谱法测定氟喹诺酮类抗生素的含量条件 色谱柱 AlltechAlltimaC18 柱温为室温 流动相 柠檬酸 0 2mol l 甲醇 乙腈 3 1 84 16 流速1 0ml min 检测波长 275nm 进样量 10 l 3 5蛋白质的检测 凯氏定氮法消化整流装置的清洗蒸馏滴定计算 计算 式中X 蜂王浆中蛋白质的含量 v1 滴定试样时0 01mol l盐酸标准溶液消耗的体积 单位为毫升 ml v0 滴定空白时0 01mol l盐酸标准溶液消耗的体积 单位为毫升 ml c1 盐酸标准溶液的浓度 单位为摩尔每升 mmol l 14 008 氮的毫摩尔质量 单位为克 g m 样品的质量 单位为克 g 6 25 氮换算为蛋白质的系数 3 6癸烯酸的测定 用液相色谱法测癸烯酸的含量液相色谱条件 测定波长 210nm 柱温度 35 流动相 CH3OH 0 03mol l HCl H2O 55 10 35流速 1ml min 进样量 10 l 结果计算 式中 X2 蜂王浆中癸稀酸的含量 F 校正因子 Ai 试样中被测组分峰面积 As 试样中内标物峰面积 ms 内标物质量 单位为克 g mi 试样质量 单位为克 g 四实验结果 4 1溶剂法溶剂法中用磷酸盐缓冲液脱除出来的抗生素在液相里检测不出来 原因可能是5g蜂王浆中的抗生素含量太少了 在液相里面检测不出来 因此初步确定用溶剂法中 在取用5g样品和本实验条件下 不能对抗生素进行有效检测 4 2离子交换法4 2 1蜂王浆中蛋白质的含量阴离子交换法萃取抗生素 滴定时消耗的HCl的体积 2 05 2 00 2 10 3 0 12 2 05 0 05阴离子萃取后的蛋白质含量 11 07 达标 阳离子交换法萃取抗生素 滴定时消耗的HCl的体积 1 35 1 30 1 25 3 0 05 1 30 0 05阳离子萃取后的蛋白质含量 6 92 不达标 4 2 2蜂王浆中癸稀酸的含量原液的液相色谱图原液的峰面积 62 95 阴离子交换法处理过的癸稀酸的峰面积 17 03 不达标 阳离子交换法处理过的癸稀酸的峰面积 59 21 达标 4 2 3结论阴阳离子交换法萃取抗生素的过程中 蜂王浆过阳离子交换柱 过柱后对癸烯酸的影响较小 而蛋白质的量损失大 并且不能达到标准 蜂王浆过阴离子交换柱 过柱后癸稀酸的量损失较大也不能达到标准 相对蛋白质的影响较小 这两种方法对蜂王浆的有效成分蛋白质和癸稀酸的影响各有侧重 因此我们不能用阴阳离子交换的方法脱除抗生素 4 3印迹法 y 118 99x R2 0 9976 0 05g l的诺氟沙星水溶液被MIPs吸附后 测得的UV 0 998 即y 0 998 根据公式求的x 0 008387 所以诺氟沙星被吸附的量 0 05 4x 10 10 3 0 1645 10 3g 0 1645mg 即干燥的1 5gMIPs能吸附诺氟沙星0 1645mg 4 3 1MIPs对抗生素的吸附 诺氟沙星 UV标准图 4 3 2蜂王浆中抗生素的脱除情况 T 14min 16min为抗生素诺氟沙星的出峰的时间 左图为蜂王浆吸附前的液相色谱图 诺氟沙星的峰面积A5 51 69 右图为蜂王浆吸附后的液相色谱图 诺氟沙星峰面积A 20 59 通过比较可以明显的发现诺氟沙星的量减少了 这也说明MIPs对蜂王浆中的氟喹诺酮类抗生素确实也有吸附作用 4 3 3蜂王浆中蛋白质的含量蜂王浆先进行离心再进行抗生素脱除 蛋白质含量基本上没有多大变化 计算同4 1 2 蜂王浆中蛋白质总含量 16 39 离心后上清蛋白质含量 2 29 剩余蜂王浆的蛋白质含量 16 39 2 29 14 10 达标 4 3 4蜂王浆中癸稀酸的含量 癸稀酸的出峰时间在6 1min左右 左图为蜂王浆吸附前的液相色谱图 癸稀酸的峰面积A 62 95 右图为蜂王浆吸附后的液相色谱图 癸稀酸的峰面积A 53 71 通过比较 我们发现癸稀酸的量基本上没有多大变化 因此我们认为MIPs脱除蜂王浆中抗生素对癸稀酸没有影响 4 3 5结论印迹法中用MIPs除蜂王浆中氟喹诺酮类抗生素的效果明显 而且对蜂王浆中的有效成分癸烯酸和蛋白质都没有太大的影响 该聚合物具有热稳定性强 机械稳定性高 可以长期使用的优点 可将其用作固相萃取剂 识别并分离富集食品中的诺氟沙星 五总结 溶剂法 在取用5g样品和本实验条件下 不能对抗生素进行有效检测 阴阳离子交换